黔中地区典型土地利用方式转变对微生物群落结构的影响

杜家颖，涂成龙，盛茂银，崔丽峰，陈琢玉，张林楷

（1.贵州师范大学喀斯特研究院，贵阳 550001；2.中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室，贵阳 550002；3.开阳县国土资源局，贵州开阳 550308）

土壤微生物是土壤中重要的活体成分，也是土壤性质的重要指标[1]。磷脂脂肪酸（PLFA）是微生物细胞膜的主要成分，对微生物群落结构具有一定的指示作用[2-3]。土壤微生物群落结构和活性是土壤生物过程中重要的限制因子，且在很大程度地决定了生物地球化学循环、土壤肥力、土壤质量以及土壤有机碳的循环过程[4]。细菌、真菌、放线菌等微生物的比率也是反映土壤肥力状况的重要指标[5]。因此，磷脂脂肪酸在生态学、地球化学等学科研究中被广泛用作生物标志物以指示元素循环方向和速率、植被演化过程[6-7]。

土壤中的微生物以其丰富的生物多样性使它们成为生态系统中最活跃和最具影响力的组分之一[8]。几乎上所有的土壤生态过程中都直接或间接与土壤微生物相关。在过去的微生物研究中，多依赖于传统的方法对土壤微生物进行分析，但是传统方法能够分离鉴定到的微生物只占土壤微生物总数的0.1%～1%[9]。用磷脂脂肪酸研究方法不仅可以检测样品中60%的微生物量，而且能增加实验数据的准确性。因此，PLFA法被广泛地运用于鉴别土壤微生物群落结构和生物总量的研究中。

随着人类社会经济活动对自然生态系统不断影响，土壤微生物显得尤为重要，利用PLFA分析方法研究土壤微生物是当今热点之一[10]。目前，单一研究不同土地利用方式对土壤理化性质、生态化学计量学、微生物群落结构的影响较多，而运用PLFA方法来研究土地利用方式转变对于土壤微生物数量、活性、结构的影响相对较少[11-12]。因此，本研究选取林地、农用地、撂荒地3种具有明显关联性的土地利用方式，运用PLFA方法研究土地利用方式转变对土壤微生物活性、数量、以及群落结构的影响，为研究区提高、检测土壤肥力，并合理地可持续利用土地资源提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 研究区概况

研究区位于贵州省毕节市黔西县新仁苗族乡，中心点坐标为（东经 105°47′～106°26′、北纬 26°45′～27°21′间），属于云贵高原东部脊状斜坡南侧向广西丘陵倾斜的斜坡地带，总面积68.9 km2。地貌类型为典型的喀斯特高原峡谷，地势起伏大，类型复杂多样，碳酸盐岩分布广泛。多年平均气温14.2℃，最低月平均气温3.3℃（1月），最高月平均气温23℃（7月），极端最高气温35.4℃，降雨量1 087.5 mm、日照时长1 066.9 h、无霜期271 d。林地没有经过人为干扰，以灌木、草木为主；农用地中以玉米和油菜轮作为主；撂荒地撂荒时间在6年以上，以杂草为主。3个样点同属一块坡面斜坡地带，主要区别仅为土地利用方式不同。因此，本研究应用空间代替时间的方法，将其视为土地利用方式转变的3种形态。

1.2 土壤理化性质测定

2017年6月，在3种不同土地利用类型下各设置3个随机分布的重复取样点，用土钻采集器分别采集 0～20、20～60和 60～100 cm 深度的土壤。采集回来的土样，除去其中的细根、砾石等杂质后，分2份储存。一份经过冷冻干燥，过2 mm筛，用于土壤微生物分析。另一份则风干磨碎后用于土壤基本理化性质测定。土壤pH采用pH计测定，水土比为1∶2.5；土壤有机质采用硫酸重铬酸钾氧化—外加热法测定[13]107、全氮采用半微量开氏法—流动注射仪测定[13]147、全磷采用NaOH熔融-钼锑抗显色—紫外分光光度法测定[13]168。

1.3 土壤微生物PLFAs分析[14]

在野外采集土壤样品，带回实验室进行冷冻干燥后，取15 g准备好的土样（干重）置于50 mL离心管中，加15 ml 0.2 mol/L的KOH-甲醇溶液，振荡5 min后，放入37℃水浴1 h（期间每10 min振荡1次）。取出后加入3 ml 1.0 mol/L的醋酸溶液中和，充分摇匀后，再加10 mL正己烷，充分摇匀。放入离心机中离心15 min后，取上层液体于玻璃试管中，氮气吹干使溶剂挥发。然后在玻璃试管中加入0.5 mL体积比为1∶1的正己烷甲基丁基醚溶液，充分溶解3～5 min，转入GC小瓶，同时加入10 mL浓度为1 mg/mL的内标，上机GC仪器进行测定。所用有机溶剂均为色谱纯。

1.4 土壤微生物群落PLFA的标记分析与含量测定

现将目前已鉴定认同对细菌、真菌、嗜热解氢杆菌、革兰氏阴性细菌具有指示意义的PLFA列入表1。

表1 表征土壤微生物的PLFATable1 PLFA characterizing soil microbes

1.5 统计分析

采用Excel 2010、SPSS 22.0软件进行数据处理和统计分析，用主成分分析法PCA（principal component analysis）对磷脂脂肪酸数据进行分析。采用SPSS22.0对不同土地利用类型下土壤C、N含量以及C/N的差异进行分析。

2 结果和分析

2.1 土地利用转变对土壤理化性质的影响

依据空间换时间的方法，本研究假定林地-农用地-撂荒地为同一序列的不同时间段。从表2可知，当林地转化为农用地后，表层、中层、深层土壤pH值均有明显升高现象，且达到了显著水平（P＜0.05）。表层有机质的含量水平没有显著变化，中层、深层土壤中有机质的含量有明显降低现象，且达到了显著水平（P＜0.05）。由于人为氮肥的施入，表层、中层农用地表层土壤的氮含量显著高于林地，且达到了显著水平（P＜0.05）；深层受到施肥的影响较小，从而深层农用地土壤的氮含量显著低于林地，且达到了显著水平（P＜0.05）。这进而引起了碳氮比发生显著变化，表层、中层林地土壤的C/N显著高于农用地，且达到了显著水平（P＜0.05）；深层林地、农用地的土壤C/N无显著变化。

表2 3种不同土地利用方式下农田土壤的基本性质Table2 Basic soil properties under three different land use patterns in farmland soils

当农用地被废弃成为撂荒地后，表层、中层土壤pH有明显降低，且达到了显著水平（P＜0.05）；深层土壤pH有明显升高，且达到了显著水平（P＜0.05）。表层有机质的含量水平有明显降低，且达到了显著水平（P＜0.05）；中层、深层土壤有机质的含量水平有明显升高，且达到了显著水平（P＜0.05）。表层农用地土壤的氮含量显著高于撂荒地；中层农用地土壤的氮含量显著低于撂荒地；深层农用地、撂荒地的土壤的氮含量无显著变化。这进而引起了碳氮比发生显著变化，表层碳氮比没有发生显著变化；中层、深层碳氮比发生显著变化，农用地低于撂荒地，且达到了显著水平（P＜0.05）。

2.2 土壤微生物的PLFA种类和总量比较

从表3可知，就PLFAs总量而言，在0～20 cm土壤中，林地显著高于农用地和撂荒地，农用地与撂荒地无显著变化。在20～60 cm土壤中，林地显著高于农用地和撂荒地，农用地显著高于撂荒地。在60～100 cm土壤中，林地显著高于农用地和撂荒地，农用地与撂荒地无显著变化。有9种PLFA在3种不同土地利用方式的土壤中均有出现。细菌中，C16：0含量均高于 C15：0、C20：0 细菌含量；真菌中，C18：2n6c含量高于 C18：1n9c、C18：3n6c、C18：3n3。细菌、真菌、革兰阴性菌、嗜热解氢杆菌中林地含量都显著高于撂荒地和农用地，且真菌中的C18：3n3生物标记只在0～60 cm的土层分布。总的PLFA而言，林地显著高于农用地和撂荒地，且0～20 cm的土层包含了60%的微生物群落，农用地与撂荒地无显著变化。这也说明了林地转变为农用地伴随着微生物群落的降低，而撂荒地则与农用地的变化相差不大，这可能是撂荒时间较短的原因。

表3 不同植被群落土壤微生物PLFA的类型及含量Table3 Types and contents of PLFA in soils of different land use patterns

2.3 不同土壤深度的土壤微生物群落组成比较

在3种不同土地利用类型中，代表细菌、真菌、革兰阴性菌、嗜热解氢杆菌的PLFAs含量分别为0～20＞20～60＞60～100 cm；且随着深度的增加，PLFAs含量逐渐减少（图1）。在林地中，0～20 cm土壤的细菌、真菌、革兰阴性菌、嗜热解氢杆菌都显著地高于20～60、60～100 cm；20～60 cm 除革兰阴性菌以外，细菌、真菌、嗜热解氢杆菌含量显著高于60～100 cm。在农用地中，0～20 cm土壤的细菌、真菌、革兰阴性菌、嗜热解氢杆菌都显著地高于20～60、60～100 cm；20～60和60～100 cm除革兰阴性菌以外，细菌、真菌、嗜热解氢杆菌含量无显著差异。在撂荒地中，0～20 cm土壤的细菌、真菌、革兰阴性菌、嗜热解氢杆菌都显著高于 20～60、60～100 cm；20～60 和 60～100 cm 的细菌、真菌、革兰阴性菌、嗜热解氢杆菌含量无显著差异。

2.4 不同土地利用方式下土壤微生物PLFA主成分分析

应用主成分分析法的思路对土壤PLFAs的进行分析，共提取 6 个主成分，分别是 C16：0 X1，C18：2n6c X2，C16：1n9c X3，C18：0 X4，C22：2 X5，C17：1 X6。使用统计软件SPSS计算，得出特征值、主成分贡献率与累计贡献率。从表4和表5可以看出主成分有6个最大的特征值，即 5.724，2.559，2.064，1.561，1.487，1.165，第一、第二、第三、第四、第五、第六主成分的累积贡献率己达76.629%。这说明前6个主成分提供了足够的原始数据信息，完全符合分析的要求。结果表明，细菌、真菌、革兰氏阴性菌和嗜热解氢杆菌PLFAs含量在土壤微生物中占主导地位，是影响土壤生物群落的主要成分之一。

2.5 不同土地利用方式下土壤理化性质与微生物PLFA相关性

从表6可知，细菌、真菌、革兰氏阴性菌和嗜热解氢杆菌PLFAs含量与土壤有机碳在0.01置信水平下呈显著正相关；与pH、全氮含量呈负相关关系；与C/N呈正相关关系。

3 讨论

3.1 土壤理化性质对PLFA的影响

植物养分的主要来源是土壤，不同的生态环境、土地利用方式都会引起土壤生态过程的变化以及土壤C、N含量、PLFA的差异。研究区林地的土壤有机碳、全氮、碳氮比均大于撂荒地和农用地，表明在人为干扰情况下，撂荒地和农用地的土壤性质有所下降，土壤养分发生明显退化，这与兰志龙等[20]的研究结果类似。土壤微生物群落的多样性与土壤理化性质息息相关，是土壤养分、凋落物和根系分泌物等因素共同作用的结果，反映了土壤理化性质与土壤微生物之间的密切关系[21]。

3.2 不同土地利用方式转变下对微生物的影响

土壤微生物多样性是反映生态系统受干扰后细小变化的重点监测因子，它可以描述微生物群落变化、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落的影响[22]。不同土地利用方式是影响土壤微生物群落结构差异最主要的因素之一。植被类型与管理制度的不同是引起土壤微生物群落变化的主要因素，选用林地、农用地、撂荒地3种不同土地利用方式，间接地反映了林地转化为农用地，农用地转化成撂荒地的结果。张娣等[23]的研究也显示，耕作下的土壤、退耕还草土壤、原生态土壤3种不同土地利用方式下土壤微生物群落结构中优势菌群有差异。刘明等[24]研究不同农林利用方式下红壤微生物生物量和代谢功能多样性等土壤质量指标的变化，结果表明红壤地区不同利用方式能对土壤微生物生物量及群落结构产生影响。本研究与张娣等[23-24]的研究结果类似。田倩等[25]研究表明，植被类型对微生物群落的影响，目前集中于植被群落的多样性、不同植被的根际、根系以及同一植物不同基因型间或不同根区、根际对土壤微生物群落影响方面的研究。本文研究结果表明，不同土地利用方式下的PLFAs含量表现为细菌＞真菌＞革兰氏阴性菌＞嗜热解氢杆菌，而细菌、真菌在林地、农用地、撂荒地中占主导地位，这主要是由于在采样期间在6月份，湿度与温度有利于细菌的生长。从研究中可以看出，PLFAs含量表现为林地＞农用地＞撂荒地，这是由于植被类型决定的。在林地中，植被群落较为复杂，而农用地、撂荒地植被相对单一，则PLFAs含量较少，且随着土壤深度的增加，微生物含量呈下降的趋势。

图1 不同土壤剖面的磷脂脂肪酸总量以及细菌、真菌、革兰阴性菌、嗜热解氢杆菌的PLFA含量Figure1 Total PLFA，PLFA contents characterised by bacteria，fungi，gram-bacteria，hydrogenobater in different soil profiles

表4 土壤微生物PLFA的特征值和主成分累计贡献率Table4 The characteristics of soil microbial PLFA and the cumulative contribution rate of principal components

表5 土壤微生物PLFA的主成分载荷矩阵Table5 The principal component load matrix of soil microorganism PLFA

表6 土壤微生物指标与土壤理化性质的相关分析Table6 Pearson correlations coefficients between microbial variables and soilphysico-chemical characteristics

3.3 不同土壤层次对微生物的影响

对影响土壤的驱动因子进行定量分析，以便进一步探讨微生物和土壤之间的相互关系。不同土地利用类型下的PLFAs种类有很多，这些PLFAs因素不仅与因变量-不同土地深度之间存在着相关关系，而且相互之间还存在耦合关联；影响土壤微生物群落的其中一个因素是土壤结构，土壤结构相似，则微生物群落结构也相似，但不同土地方式下，微生物群含量也随之变化。本研究中表示，细菌、真菌、革兰氏阴性菌、嗜热解氢杆菌的PLFAs在土壤中占主导地位，且随着深度的增加而呈现递减趋势。细菌、真菌、革兰氏阴性菌、嗜热解氢杆菌越多，则表示土壤肥力越强；嗜热解氢杆菌在一定深度后，其减少的趋势相对不明显，但是在土壤微生物群落中是不可缺少的一部分。在土壤表层0～20 cm的土层中，集中了60%以上的土壤微生物，20～60 cm和60～100 cm土层的微生物数量相差不大，虽然有下降的趋势，但不是很明显，这与刘海燕[26]的研究类似。

3.4 土壤理化性质与PLFA间的相关性

根据Pearson相关系数分析，上述5个指标（PLFAs总量、细菌、真菌、革兰氏阴性菌、嗜热解氢杆菌的PLFAs）与土壤C含量呈正相关，与N含量呈负相关，但是与N含量相关性不大，这表明不同土壤的土壤微生物受到C含量变化的影响[26-27]。A.Sessitsch等[28]对长期不同施肥条件下土壤颗粒中的微生物群落结构进行分析，结果表明在同一粒径下，有机质含量越高，微生物多样性越丰富，即土壤有机质含量会显著影响土壤微生物的群落结构。研究表明，土层0～20 cm的土壤PLFAs高于土层20～60 cm、60～100 cm的土壤PLFAs，林地的土壤PLFAs高于农用地和撂荒地的土壤PLFAs，且都与有机碳含量和C/N呈现正相关关系，这就说明了土壤PLFA的丰富度、多样性指数都与土壤质地密切相关，而PLFA是微生物细胞的主要成分，说明土壤微生物的丰富度、多样性与土壤质地密切相关。C.Kramer等[9]用PLFA方法分析自然状况下以及添加石灰后的森林土壤微生物群落变化情况，结果表明，pH的变化对微生物有影响，而研究中，PLFA总量、细菌、真菌、革兰氏阴性菌、嗜热解氢杆菌的PLFA与pH呈现不显著负相关关系，这与C.Kramer等[9]的研究结果有出入。