一株酱香白酒放线菌代谢产物活性及其对酿造环境中功能菌的作用

尤小龙，黄永光，黄蕴利，胡 峰，胡建锋，钟方达

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州习水564622）

放线菌是一类革兰氏阳性细菌，主要菌丝体呈分枝状。从Cohn发现放线菌至今已有100多年的历史，1942年链霉素的发现，以及20世纪五六十年代抗生素工业的兴起，极大地促进了放线菌分类学研究的发展。这其中，土壤放线菌[1-3]、海洋放线菌[4-6]、植物内生放线菌[7-9]和极端条件下放线菌[10-12]的研究报道较多。而在白酒酿造领域，放线菌的作用同样不可忽视，放线菌对于白酒酿造过程中微生物群落的形成[13-14]，对白酒中化学成分的生成[15]，以及对于各种代谢产物多样性的影响都是不可忽视的。近年来，白酒中对于放线菌的分离鉴定与群落观察取得了很多成果[16-18]，放线菌对于白酒风味影响的研究也不断见诸报道[19-21]，但是对于白酒中放线菌生物活性的研究相对比较单薄。白酒酿造基础核心是功能微生物因独特的酿造环境发挥基础作用和生物调节作用[22-23]，而放线菌在当今学术领域的研究受到重视的重要原因之一就是因为大部分放线菌的代谢产物都具有生物调控作用。放线菌如果能在白酒的酿造环境中，代谢出可以影响其他功能细菌、酵母菌、霉菌的生物活性物质，必然会对白酒酿造微生物的生长、风味物质以及酒精的代谢甚至对整个微生态环境都产生很大的影响[24]。本研究通过研究酱香型白酒生产过程分离出的放线菌Streptomyces albusS5代谢产物的生物活性，并在此基础上通过分离鉴定Streptomyces albusS5的生物活性化合物，初步阐明了Streptomyces albusS5的生物活性作用机制，研究结果可以用于分析放线菌Streptomyces albusS5与酿造环境其他功能微生物的生物学关系，解释某些与放线菌有关的白酒酿造工艺科学原理，希望研究结果可以进一步阐明放线菌在白酒中的主要作用，为改进酿造工艺、提高白酒质量甚至促进白酒产业的发展打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌株：Streptomyces albusS5，分离自茅台镇5000 t规模以上的酱香型白酒生产企业，现保存于本课题组重点实验室；Baclicus lincheniformisB5，与Streptomyces albusS5分离自同一生境，其生长较好且传代性能稳定，具有较明显的酱香产香功能，保藏于本课题组重点实验室；Wickerhamomyces anomalusY2，与Streptomyces albusS5分离自同一生境，生长较好、传代稳定，并具有较强的产酒精能力，保藏于本课题组重点实验室。

试剂及耗材：蛋白胨、琼脂粉、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸镁、可溶性淀粉、明胶、重铬酸钾、氯化钠、D-葡萄糖、无水乙醇、冰醋酸，以上试剂均为分析纯。

仪器设备：恒温振荡摇床SHZ-82A、Beckman冷冻离心机Allegra,64R，上海智岩科学仪器有限公司；旋转蒸发仪RE-2000E、生化培养箱SPX-250B，上海琅玕实验设备有限公司；Waters 600型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.2 培养基制备

放线菌种子培养基（g/L）：酵母膏10，葡萄糖5，KNO30.5，K2HPO40.25，MgSO4·7H2O 0.25，NaCl 0.25，FeSO40.25，可溶性淀粉 10，以 121 ℃灭菌20 min。

高氏一号固体培养基（g/L）：KNO30.5，K2HPO40.25，MgSO4·7H2O 0.25，NaCl 0.25，FeSO40.25，可溶性淀粉 10，琼脂20，121 ℃灭菌20 min。

高氏一号液体培养基（g/L）：KNO30.5，K2HPO40.25，MgSO4·7H2O 0.25，NaCl 0.25，FeSO40.25，可溶性淀粉 10，121℃灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨固体培养基（g/L）：NaCl 5，蛋白胨10，牛肉膏3，琼脂20，121 ℃灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液体培养基（g/L）：NaCl 5，蛋白胨10，牛肉膏3，121 ℃灭菌20 min。

1.3 实验方法

1.3.1Streptomyces albusS5代谢产物的富集

将Streptomyces albusS5在30℃、摇床转速为230 r/min、发酵液装液量为50 mL/250 mL、发酵时间为60 h的发酵条件下进行发酵，每一批发酵50瓶，共发酵50 L发酵液，发酵液处理方法如下：用Beckman冷冻离心机于4℃下冷冻离心20 min，分离上清液和沉淀菌丝。将上清液pH值调整至微碱性后，用乙酸乙酯等体积萃取2次后，旋转蒸发至1/200体积。菌丝用50 mL甲醇浸泡一夜，隔日用Beckman冷冻离心机于4℃下再次冷冻离心20 min，取甲醇上清液。合并处理过的上清液和处理过的菌丝浸泡液，旋转蒸发至1/200体积，冰箱保存备用。

1.3.2Streptomyces albusS5代谢产物的分离

硅胶柱层析：将200～300目硅胶柱预处理后以湿法装柱装入30×400的层析柱，装柱体积为柱体积的2/3，用乙酸乙酯-石油醚体系进行洗脱，分别按浓度比例乙酸乙酯与石油醚体系分为2∶8、4∶6、6∶4、8∶2、纯乙酸乙酯5个梯度，每个梯度洗脱体积均为200 mL，流速约为1 mL/min，每20 mL收集1次，收集得到的洗脱液利用薄层色谱法点板确认成分，合并相同组分，减压浓缩后进行抑菌生物活性实验，合并有抑菌活性的组分继续进行下一步分离。

凝胶柱层析：将葡聚糖凝胶（sephadex）-LH20预处理后，以湿法装柱装入50×1200的层析柱中，待其中凝胶介质稳定后采取湿法上样。凝胶层析柱使用氯甲体系进行洗脱，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇=1∶10，流速0.3 mL/min，每瓶收集3 mL，之后使用薄层色谱分析，并合并相同组分。

生物活性实验：用凝胶处理完后得到的洗脱液，对Baclicus lincheniformisB5与Wickerhamomyces anomalusY2进行牛津杯实验确认其生物活性。具体操作如下：平板培养基涂布之后，取1个内径为6 mm的无菌牛津杯平稳放置，向杯中注入150 μL用1.3.1方法处理的Streptomyces albusS5发酵液，空白对照组采用分析纯的甲醇加入牛津杯，培养3 d，每1个平行样处理3次，培养48 h后用十字交叉法测量抑菌圈，结果取3个平行样的平均值。

1.3.3Streptomyces albusS5代谢产物的鉴定

将含有活性物质的洗脱液进行紫外扫描后，在对应波长下进行HPLC实验，结合LC-MS进行Streptomyces albus S5代谢活性物质分子量的解析。

2 结果与分析

2.1 Streptomyces albus S5代谢产物生物活性成分分析

2.1.1Streptomyces albus S5代谢产物的生物活性确认

Baclicus lincheniformisB5和Wickerhamomyces anomalusY2牛津杯实验结果见图1，StreptomycesalbusS5的代谢活性产物对Baclicus lincheniformisB5有明显生物活性，而对Wickerhamomyces anomalusY2却未表现出生物活性，这说明菌株S5的代谢产物中有生物活性的成分，对细菌有较强的生物活性，而对酵母菌此类真菌并没有明显影响。

图1 Streptomyces albusS5层析洗脱液的抑菌结果

2.1.2 洗脱液衍生化后进行HPLC分析

Streptomyces albusS5代谢的活性物质经全紫外扫描并未发现紫外特异吸收峰，这说明具有生物活性的组分没有能对紫外产生吸收的基团，如果要用高效液相对其进行检测，对其进行衍生化后产生具有紫外吸收的基团，才能用HPLC进行分析。Streptomyces albusS5的代谢活性产物对细菌作用明显，对酵母无显著作用，分析其极可能为聚醚类抗生素，用聚醚类抗生素的衍生方法衍生后进行HPLC检测。

衍生化条件：取抑菌液700 μL，加入100 μL三氯醋酸水溶液（500 mg/mL），混旋20 s，放置10 min后加入200 μL二硝基苯肼甲醇溶液（1 mg/mL），混旋20 s后在55℃中水浴30 min，冷却后上机。用安捷伦高效液相色谱仪进行液相分析，液相条件如下：甲醇∶1.5%醋酸水溶液=90∶10，流速1 mL/min，柱温30℃，波长392 nm。高效液相色谱结果如图2。

用未衍生的洗脱液，衍生后的洗脱液，以及没有加入洗脱液的纯衍生液分别上样，进行HPLC检测，结果显示，未衍生的洗脱液主要在保留时间3 min之前，峰形混乱，分析其为杂质峰；纯衍生液仅在2 min有明显峰形，分析其为衍生液和杂质的混合峰；衍生过的洗脱液，在12 min和15.7 min都有明显峰形，综合分析结果表明，保留时间为15.7 min的物质就是Streptomyces albusS5代谢活性物质，经过查阅相关资料也与其他研究中得到的结果相似，根据以上实验结果，可以将Streptomyces albusS5的活性代谢产物衍生后用HPLC检测。

图2 Streptomyces albusS5未衍生洗脱液，衍生过的洗脱液，纯衍生液高效液相色谱图

2.1.3Streptomyces albusS5活性代谢产物的LCMS分析

对Streptomyces albusS5代谢的活性物质进行LC-MS分析，结果见图3。在电子流较强的信号段，离子碎片的质荷比（m/z）主要有773.5和789.5，结合LC-MS工作原理，Streptomyces albusS5代谢活性产物的分子在自身基础上去掉一个氢离子，加上一个钠离子，得到分子量为751-1+23=773，去掉氢离子加上一个钾离子得到分子量为751-1+39=789，分析可得Streptomyces albusS5代谢活性产物分子量是751。此外，质谱图中几乎没有显示代谢活性产物本身的分子量为751，说明该Streptomyces albusS5代谢活性产物极容易和金属离子结合，这也是聚醚类抗生素的一个特征。

根据上述结果，Streptomyces albusS5代谢活性产物比起酵母菌对细菌作用更加明显，无紫外吸收基团，分子量大致为751，Streptomyces albusS5经分子鉴定，是白色链霉菌(Streptomyces albus)，综合上述结果进行相关资料查阅，分析Streptomyces albusS5代谢活性产物极可能是盐霉素（Salinomy-cin）。

那此产物到底是否为盐霉素（Salinomycin），还需要下一步实验进行验证。

图3 Streptomyces albusS5液质联用检测结果

2.2 Streptomyces albusS5代谢活性产物成分验证

2.2.1 内标法确认成分

根据前面的结论，分析Streptomyces albusS5极可能是盐霉素（Salinomycin），将盐霉素标样配制成浓度为600 μg/mL的标准品溶液后，用2.1.2中的衍生方法处理过后，Streptomyces albusS5代谢活性物质的衍生液中，再进行HPLC，监测保留时间15.7 min的峰形如何发生变化，HPLC结果见图4。

图4表明，加入盐霉素标样后，原保留时间15.7min的峰形明显增大（实验过程中硅胶柱内压发生了变化，所以导致原15.7 min保留时间的目标峰略微向后漂移，不过经过反复核对分析，此现象对实验结果并未造成影响），说明加入的内标物质使Streptomyces albusS5活性代谢产物浓度发生了改变，内标物盐霉素，正是Streptomyces albusS5的代谢活性产物。比对加入标样前后的色谱图，可以发现，从Streptomyces albusS5发酵液中提取的代谢产物的浓度，低于加入标样的浓度（600 μg/mL）。

2.2.2Streptomyces albusS5洗脱液中活性物质浓度确认

将盐霉素标样配制成不同浓度的溶液，衍生化后进行HPLC实验，部分高效液相色谱结果见图5。

图4 样品内标法液相色谱图

图5 不同浓度标样高效液相色谱图

由图5可知，随着盐霉素标样浓度的升高，峰形也有显著增大，具体盐霉素浓度与峰面积对应关系如下：衍生过的洗脱液峰面积为1852，400 μg/mL的峰面积为4006，500 μg/mL的峰面积为4486，600 μg/mL的峰面积为5914，700 μg/mL的峰面积为6753，800 μg/mL的峰面积为7863，900 μg/mL的峰面积为8759。以此数据绘制标准曲线（见图6）：y=9.5814x+135.73，其中y为峰面积，x为浓度值（μg/mL），将衍生过的洗脱液峰面积带入标准曲线中计算得到洗脱液中盐霉素浓度为174 μg/mL，并以此浓度进行Streptomyces albusS5盐霉素产量的推算：174 μg/mL的盐霉素溶液有30 mL，由Streptomyces albusS5发酵液50 L处理得到，查阅相关资料估算乙酸乙酯萃取收率在50%，Streptomyces albusS5发酵液中盐霉素的浓度约为210 μg/L，一些研究中经过诱变的盐霉素高产白色链霉菌发酵液中的盐霉素浓度甚至可以达到20 mg/mL[25]，与之相比，Streptomyces albusS5的盐霉素产率很低，主要原因是菌种和环境的差异，即使本来有盐霉素产率很高的白色链霉菌在白酒酿造环境中经过长期变异与质粒交换，其产盐霉素的产率也会大大降低。盐霉素对一些对其极为敏感的芽孢杆菌的最低抑制浓度约为 0.25 μg/mL[26]，略高于Streptomyces albusS5的盐霉素产量，故Streptomyces albusS5对于白酒酿造环境虽然会有一定影响，但是不会造成毁灭性的破坏。

用活性实验对Streptomyces albusS5的代谢活性产物进行验证，根据标准曲线洗脱液中Streptomyces albusS5代谢的盐霉素浓度为174 μg/mL，如果与相同浓度盐霉素标品一起进行活性实验并且能得到相似的结果，那么就进一步证明，Streptomyces albusS5的代谢活性产物就是盐霉素（Salinomycin）。

图6 盐霉素标准曲线

将盐霉素标样配制成为不同浓度溶液，与Streptomyces albusS5洗脱液同时进行活性实验，部分活性实验结果见图7。经过十字交叉法测量，在浓度为 100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL的盐霉素标样抑菌圈直径分别为8 mm、16 mm、31 mm，而洗脱液的抑菌圈直径为15 mm。在牛津杯实验中，洗脱液得到了与200 μg/mL的盐霉素标样相似的结果，而经过标准曲线换算Streptomyces albusS5的代谢活性物质在洗脱液中浓度为174 μg/mL时，也与200 μg/mL相近，这说明生物活性实验结果与HPLC实验结果互相对应，共同证明了Streptomyces albusS5代谢活性产物成分为盐霉素（Salinomycin），并且在洗脱液中，其浓度约为174 μg/mL。

图7 不同浓度盐霉素标样生物活性实验结果

3 结论

通过对Streptomyces albusS5代谢产物的硅胶柱分离、凝胶柱分离，对其进行活性验证后通过LC-MS和衍生化后HPLC分析其具体成分，得到结论如下：Streptomyces albusS5代谢活性物质细菌较显著，对酵母菌这类真菌效果较差，无紫外吸收基团，衍生化后结合LC-MS得知其分子量为751，极易与金属离子结合，综合分析其为盐霉素（Salinomycin）。经过内标法与活性实验确认，Streptomyces albusS5代谢的生物活性物质确实为盐霉素（Salinomycin），Streptomyces albusS5通过液体发酵的盐霉素的产率约为210 μg/L。