实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用研究

覃茂峰

我国对于转基因作物的成分有着严格的规定。当下常见的转基因作物类型有很多，但是都需要对这些作物进行严格的基因检测，才能流入市场。这就需要选择合适的技术，能够高效、快捷的加以应用。目前的转基因作物检测主要有以下三方面的内容。首先是判定转基因作物的检测；其次是对该作物品系的类型进行检测；最后就是对其中的含量进行检测。综上，选择实时荧光定量PCR技术是一种最为有效的检测手段。

实时荧光定量PCR技术的基本原理

在粮油转基因成分检测时，要想了解其基因的拷贝数以及在特定组织中某些特定基因的表达量，那么就可以采用RT- PCR（RealTime PCR）技术。其基本原理是运用扩增反应过程中由循环产物产生的荧光信号来判定成分的。在实验过程中，需要在荧光化学物质的引导下，随时观察反应产物的数量，并且随着产物数量的不断增多，荧光信号强度也会随之增强。在这一过程中，我们可以根据监测物产量的变化，制定出一条实时荧光扩增曲线图。这个曲线图通常具有三个时期，第一时期为早期的背景扩增时期，第二时期为中期阶段的指数扩增时期，第三时期为晚期的平台期。

在比较检测样本的过程中，需要设定一个阈值，这一阈值不是固定不变的，而是人为设定的一个数值。通常情况下，会设置3至15个循环荧光信号，荧光阈值的缺省设置是其标准差的10倍以上。每个模板都具有一个Ct值，这一数值与起始拷贝数息息相关，二者呈反比的关系。在实际检测的过程中，如果我们知道了标准品的起始拷贝数，那么就可以根据相关信息制定出一个标准曲线，进而通过Ct值获得样品的起始拷贝数。

转基因大豆检测的分析与结果

以转基因抗除草剂大豆为例，选取适量的样品与引物。本检测中选择来自巴西的转基因大豆以及非转基因大豆样品。花椰菜花叶病毒35S启动子、胭脂碱合酶NOS终止子作为引物。对上述样品进行核酸的提取，将其置入核酸提取试剂盒中，分别采用CTAB法以及GMO试剂盒法对DNA进行制备。

准备阶段完毕后，观察PCR的反应。分别要观察常规PCR的反应以及实时荧光定量PCR的反应。在常规PCR检测中，先对大豆样品的DNA进行扩增，在94℃的预变性环境下进行40个循环，时间为3min；继续在94℃的变性环境下持续20s，降低温度至54℃，时间持续40s，进而在72℃的温度下延伸60s，最后持续3min完毕。对上述产物进行检测，检测工具为2%的琼脂糖凝胶电泳，作用是将非目的DNA片段以及缓冲溶液等不需要的杂质去除干净。

实时荧光定量PCR技术扩增实验中，PCR的反应体系为25μL。其中包含反应缓冲液5μmol/L，样品核酸2μmol/L以及引物2μL等。具体的扩增反应条件如下：在95℃的预变性环境下进行循环，时间为10min。继续在95℃的变性环境下持续10s，降低温度至55℃，持续时间为8s，升温至72℃，持续时间为10s。以上过程共计40个循环。

将上述的两种实验反应制定出标准曲线，其中横坐标为DNA初始浓度的对数值，纵坐标为临界循环值。上述两种制备方法均得到了明显的效果，都能从中提取出质量较高的基因组DNA，并且观察到大豆中的DNA无明显差异。但是在荧光定量PCR中，临界循环值具有明显的重现性，可见其精准度与常规检测相比要高出很多。同时，经过对灵敏度的检测可以发现，PCR检测中DNA的总量与检测物基因组的大小直接影响着最终检测灵敏度，也就是外源基因拷贝数。在特定的浓度标准品DNA进行分析定量分析时，标准曲线中无明显的引物二聚体变化，由此可以得到转基因大豆在定量檢测过程中的最低限值。

虽然这一检测技术在目前已经得到了广泛的认可，但是还有一些问题值得商榷，例如生成标准曲线的不统一，会造成实验结果无法进行对比。又如分析灵敏度的精准性不高等，都需要研究人员想办法加以完善。只有不断发现该技术中存在的不足，才能更好的应用在粮油转基因成分检测以及其他领域的检测活动中。