超高效液相色谱-串联三重四极杆线性离子阱质谱法同时检测猪肉中33种兽药残留

薛 焕， 金 雁， 于永丽*

(1.东北大学理学院，辽宁沈阳 110819;2.沈阳出入境检验检疫局，辽宁沈阳 110016)

随着人们对畜禽产品的需求量逐年递增，畜禽养殖企业不断兴起和扩大。为追求食品动物养殖的经济利益，越来越多的企业在动物饲养及治疗过程中滥用激素类、抗病毒类以及β-受体激动剂类兽药。但人类长期食用含有这些兽药的肉制食品，会导致兽药在人体累积，扰乱机体的激素平衡，引起药物中毒，抑制机体的免疫作用，对人体健康极为不利。

目前，国内外对于兽药残留的检测方法主要有液相色谱法[1]、气相色谱-串联质谱法[2]、液相色谱-串联质谱法[3 - 4]等。现有前处理技术主要有固相萃取[5]、基质固相分散[6 - 7]、超声波辅助提取[8]、QuECHERS技术[9 - 12]、中空纤维素膜技术[13 - 14]等。QuEChERS方法的基本原理是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附基质中的杂质从而达到除杂净化的目的。中空纤维素膜技术已广泛用于化工、生物工程和环保等领域，其原理主要是利用具有特殊选择透过性的有机高分子材料或无机材料，形成不同形态的膜，对目标物进行分离或净化。目前，尚未见对畜禽产品中兽药检测采用QuEChERS与中空纤维素膜净化相结合进行样品前处理的报道。

本研究基于畜禽产品中的猪肉样品基质特点，将QuEChERS方法与中空纤维素膜净化相结合对样品进行前处理，与单一使用QuEChERS方法相比，本实验中样品的前处理方法能够更好地降低样品的基质效应，提高兽药的回收率。将处理后的样品上机，采用超高效液相色谱-串联三重四极杆线性离子阱质谱法(UPLC-QTrap MS/MS)对猪肉中33种兽药残留同时进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent1290 Infinity Ⅱ超高效液相色谱仪(美国)；AB SciexQtrap 6500串联三重四极杆-线性离子阱质谱仪(美国)；Thermo离心机(美国)；SartoriusCPA 225D分析天平(德国)；EYELAMG-2200氮吹仪(美国)；IKA组织匀浆机(德国)。

标准品：雄烯二酮、丙酸诺龙、诺龙、达那唑、表雄酮、睾酮、美睾酮、群勃龙、氟甲睾酮、宝丹酮、丙酸睾酮、甲睾酮、苯甲酸雌二醇、炔诺酮、17α-羟基孕酮、甲基炔酮、甲羟孕酮、甲地孕酮、美仑孕酮、醋酸氯地孕酮、去氧皮质酮、醛固酮、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、马贲特罗、马布特罗、溴布特罗、克仑特罗、特布他林、莱克多巴胺、金刚烷胺、咪喹莫特，均购自Alta Sientific公司，纯度均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；十八烷基硅烷(C18)填料、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)填料、中性Al2O3填料、中空纤维素膜，均购自天津博纳艾杰尔公司。

猪肉样品购于本地市场。

1.2 标准溶液的配制

标准品储备液：将体积为1 mL的100 μg·mL-1单标溶液用乙腈稀释为10.0 μg·mL-1的储备液，置于10 mL棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中保存。混合标准溶液：根据需要取相应量的标准品储备液于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容、摇匀，置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 样品前处理

取2.0 g肉糜样品，置于50 mL离心管中，加入5 mL乙腈，经均质机均质。另取5 mL乙腈清洗均质机，将两次均质后的乙腈混合，涡旋混匀1 min后，超声20 min，9 000 r·min-1离心10 min。取6 mL上清液，置于15 mL净化管中(300 mg C18+150 mg PSA)，涡混1 min，4 000 r·min-1离心5 min。取5 mL上清液，在45 ℃下，采用氮气吹干仪浓缩至1 mL，取0.5 mL浓缩液，转移至聚丙烯中空纤维素膜组件中，4 000 r·min-1离心5 min，收集滤液，待测。

1.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱为AgelaVenusil MP C18柱(50×3.0 mm i.d.，3 μm)，柱温为25 ℃，样品室温度为室温，进样体积为5 μL，流速为0.4 mL·min-1，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脱程序为：3%B(0～1.0 min)，15%～75%B(1.1～9.5 min)，95%B(9.6～11.5 min)，3%B(11.6～13.5 min)。

质谱条件：离子源采用Turbo VTM离子源，电喷雾正电离源(ESI+)，气帘气25 psi，雾化气50 psi，辅助加热气60 psi，雾化电压5 500 V，离子源温度550 ℃。33种兽药的质谱参数见表1。

表1 33种兽药的质谱参数

(续表1)

SerialnumberCompoundRetention time(min)Ion pair(m/z)Declustering potential(V)Collision energy(eV)19Desoxycorticosterone7.63331.2/97.1*331.2/109.190283020Methyl testosterone7.84303.2/109.1*303.2/97.190343021Androstenedione7.94287.2/97*287.2/10910726302217alpha-Hydroxyprogesterone8.01331.3/97.1*331.3/109.197283323Melengestrol8.31355.2/279.2*355.2/221.270265124D-(-)-norgestrel8.4313.3/109.1*313.3/245.2100342325Epiandrosterone8.42291.2/255.1*291.2/273.27017926Megestrol8.43343.2/325.3*343.2/267.260202527Medroxyprogesterone8.71345.3/123.1*345.3/9780313028Mesterolone8.88305.1/269.2*305.1/173.2120223029Danazol9.56338.3/148.1*338.3/120.130313530Chlormadinone9.63405.2/309.2*405.2/345.370221731Nadrolone propionate10.61331.2/109.2*331.2/145.145333032Testosterone propionate10.82345.3/109.1*345.3/97.110032283317beta-Estradiol-benzoate10.91377.2/105.1*377.2/135.2692420

*Quntification ion.

2 结果与讨论

2.1 液相色谱-串联质谱检测条件的选择

图1 33种兽药混合标准的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatogram of mixed standard solution of 33 veterinary drugs20 ng·mL-1,1-33:the names of the substances are shown in Table 1.

本实验中雄激素类、雌激素类、孕激素类、糖皮质激素类药物均属于弱极性或中等极性药物，易溶于乙腈。β-受体激动剂类、抗病毒类药物属于水溶性药物，易溶于水。所以本实验选择乙腈和水的混合体系作为流动相，并在流动相中加入0.1%甲酸，以提供质谱离子化时所需的H+，保证化合物在质谱下的离子化。考虑到目标物的极性差异较大，为了保证分析物能够很好地分离，采用梯度洗脱程序，经过实验，确定具体洗脱程序见1.4节。

根据33种兽药的化学性质，质谱电离条件采用电喷雾正电离源(ESI+)。在正离子模式下，首先进行母离子扫描，确定待测药物的母离子，然后对其进行子离子扫描，确定其中丰度最强的两个子离子作为监测离子，优化子离子的去簇电压及碰撞能量，结果见表1。采用本实验所建立的液-质检测方法对标准品进行检测，33种兽药的提取离子色谱图见图1。

2.2 样品前处理方法的优化

将33种兽药的混合标准溶液(每种兽药的浓度均为5.0 ng·mL-1)加入到空白的猪肉样品中，以此作为样品溶液，对QuEChERS方法中采用的提取溶剂和净化填料以及中空纤维素膜进行了选择。

2.2.1提取溶剂的优化针对所检测的33种兽药的性质，考察了乙腈/水(体积比90∶10)、乙腈/水(体积比75∶25)、0.1%甲酸乙腈溶液、乙腈四种提取溶剂对兽药回收率的影响。实验结果表明，其中9种兽药的回收率有较为显著的差异(图2)，其余兽药的回收率在60%～120%之间。结果表明以乙腈作为提取溶剂，提取效果优于其它3种提取溶剂的提取效果。

2.2.2净化填料的优化实验先分别考察了PSA、C18、Al2O3单一填料对目标物的吸附情况，发现PSA对目标物的吸附影响最低，所以选择PSA作为基本填料，再分别加入一定量的C18和Al2O3吸附剂组成混合填料。实验结果表明，使用PSA时兽药的回收率在62.8%～91.4%之间；使用PSA和C18混合填料时回收率在72.3%～97.7%之间，使用PSA和Al2O3混合填料时回收率在49.8%～83.3%之间，所以PSA和C18混合填料的净化效果最好。然后对PSA和C18混合填料的比例，分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1 时兽药的回收率进行考察，结果表明，采用以上混合比例时，33种兽药的回收率范围分别为72.3%～97.7%、77.5%～101.2%、70.8%～108.2%、66.4%～94.7%、61.7%～95.8%。从以上数据来看，当PSA与C18混合填料比例为1∶2时，33种兽药的回收率最好。

2.2.3中空纤维素膜的选择实验考察了样品溶液在上机检测前分别经过0.22 μm滤膜和中空纤维素膜过滤净化后的效果，通过对比两种情况下兽药的提取离子色谱图(图3)，发现咪喹莫特等大部分兽药经中空纤维素膜过滤后的响应值明显高于经0.22 μm滤膜过滤后响应值，药物的回收率更高。

本实验采用的中空纤维素膜是在膜的孔表面接枝上丙烯酸基团的聚丙烯中空纤维超滤膜，丙烯酸基团的接枝进一步缩小膜孔的直径，可以达到接近纳滤的作用，可以以物理过滤的方式去除样品中大分子量杂质。因此，在肉类基质的兽药残留检验中，它比传统的滤膜具有更加彻底的净化效果，降低基质效应，提高兽药的回收率。

图2 9种兽药经四种提取溶剂分别提取后的回收率Fig.2 The recoveries of 9 veterinary drugs extracted by four different extraction solvents

图3 33种兽药过不同膜的提取离子色谱图(5 ng·mL-1)Fig.3 Extracted ion chromatograms of 33 veterinary drugs by different membrane(5 ng·mL-1)

2.3 方法学验证

配制浓度为0.5～80.0 ng·mL-1的基质匹配标准工作液进行测定，以兽药标准色谱峰峰面积(y)对其相应浓度(x)进行回归分析，得到标准曲线的回归方程和线性范围。其中，金刚烷胺、甲基泼尼松龙、醛固酮3种兽药为2.0～80.0 ng·mL-1，其余30种兽药为0.5～80.0 ng·mL-1，相关系数r为0.9901～0.9995。

在猪肉的空白样品中添加33种兽药的混合标准溶液，制成0.5、2.0和10 μg·kg-1的3个添加水平的加标样品(其中金刚烷胺、甲基泼尼松龙和醛固酮为2.0和10 μg·kg-1的2个添加水平)，按建立的分析方法进行测定。除去马布特罗在添加水平为0.5 μg·kg-1时回收率为57.1%，其余兽药在不同添加水平时的回收率为60.9%～102.3%，RSD为1.7%～22.8%。按照国家标准(GB/T27404-2008)[15]中对被测组分含量<0.1 mg·kg-1时回收率需达到60%～120%的要求，除马布特罗在加标为0.5 μg·kg-1时回收率偏低，其余兽药的回收率满足国家标准的要求。以每种兽药能够被定量测定的最低限作为定量限，金刚烷胺、甲基泼尼松龙和醛固酮的定量限为2.0 μg·kg-1，其余为0.5 μg·kg-1，以3倍信噪比作为仪器检出限，检出限范围为0.03～0.57 μg·kg-1。能够满足中国、日本、欧盟的食品安全标准要求。33种兽药的线性回归方程、定量限和回收率见表2。

表2 33种兽药的线性回归方程、定量限和回收率(n=6)

(续表2)

CompoundLinear equationLOD(μg·kg-1)LOQ(μg·kg-1)0.5 μg·kg-12.0 μg·kg-110.0 μg·kg-1Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Bromobuteroly=1.62×106x+2.30×1050.030.585.911.778.53.082.010.9Lmiquimody=9.42×106x-6.97×1050.040.587.18.685.42.589.54.6Mabuteroly=2.88×106x-4790.050.557.110.765.74.479.013.2Mapenteroly=3.95×106x-2.65×1050.100.572.212.680.12.587.216.3Methylprednisoloney=3.75×104x-5.80×1030.572.0//82.411.089.913.7Aldosteroney=1.65×104x-4.92×1030.252.0//86.26.984.17.8Hydrocortisoney=1.99×105x-1.22×1040.070.562.46.979.510.591.83.4Cortisoney=3.04×105x+1.05×1040.040.569.72.285.315.989.66.8Fluoxymesteroney=1.75×105x+4.70×1030.080.582.47.192.42.890.82.9Trenboloney=5.99×105x-1.25×1040.090.574.05.089.22.991.65.2Boldenoney=5.99×105x+5.97×1030.030.584.85.890.82.592.54.4Nortestosteroney=3.99×105x+5.22×1030.090.586.37.689.32.490.13.0Testosteroney=7.89×105x-7.04×1030.040.581.23.778.812.987.64.3Norethindroney=2.63×105x+1.05×1040.060.584.95.690.52.087.33.7Desoxycorticosteroney=8.09×105x+2.91×1030.030.565.24.770.23.789.42.8Methyl testosteroney=4.98×105x+2.33×1040.030.583.75.5102.37.790.03.1Androstenedioney=1.35×106x+6.01×1030.050.589.23.986.16.192.73.017alpha-Hydroxyprogesteroney=5.14×105x-4.42×1040.050.587.84.396.53.892.82.7Melengestroly=7.80×105x-4.00×1030.030.571.311.587.72.789.22.2D-(-)-norgestrely=2.88×105x+9.95×1030.090.588.15.392.67.490.66.1Epiandrosteroney=2.16×105x-4.47×1030.150.561.619.071.42.885.97.2Megestroly=5.02×105x-8.51×1040.120.585.712.090.39.786.73.6Medroxyprogesteroney=1.10×106x-2.41×1040.060.584.23.192.51.790.24.9Mesteroloney=2.83×105x-1.17×1040.090.582.74.285.53.385.66.9Danazoly=1.49×105x-4.66×1030.060.581.45.588.52.086.012.5Chlormadinoney=2.88×105x+5420.030.567.15.880.32.687.113.9Nadrolone propionatey=2.45×105x+1.85×1050.080.574.54.977.76.086.41.7Testosterone propionatey=6.31×105x+1.28×1050.040.575.72.688.15.485.49.517beta-Estradiol-benzoatey=1.51×105x+1.31×1050.140.576.85.082.96.394.56.5

图4 克伦特罗的提取离子色谱图Fig.4 Extracted ion chromatogram of Clenbuterol

2.4 实际样品检测

应用本研究建立的分析方法对市售猪肉样品进行了33种兽药的筛查检测，检测结果为(μg·kg-1)：特布他林0.9，克伦特罗1.6，丙酸睾酮2.5，其它30种兽药未检出，图4为克伦特罗检测图。由检测结果可知，部分兽药残留在猪肉产品中，对人们的身体健康具有潜在的危害。

3 结论

本研究将QuEChERS方法与中空纤维素膜净化相结合，建立了一种新型的样品前处理技术，在对液相色谱-串联质谱检测条件优化的基础上，利用超高效液相色谱-串联三重四极杆线性离子阱质谱仪，建立了可同时检测33种兽药的分析方法。该方法的灵敏度高、分析速度快，节约成本，可满足实验室对猪肉样品日常检验分析的要求。