氮肥和多环芳烃对农田土壤细菌群落的影响

戴叶亮 ，朱清禾，曾军，郑金伟，吴宇澄 *，林先贵

1. 中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室（中国科学院南京土壤研究所），江苏 南京 210008；

2. 南京农业大学资源环境与科学学院/农业资源与生态环境研究所，江苏 南京 210095；3. 湖泊与环境国家重点实验室，江苏 南京 210008

自20世纪70年代以来，中国氮肥用量不断增加（张卫峰等，2013），至2011年，平均氮肥用量已达到180 kg∙hm-2（以N计），比世界平均水平高75%（China Agricultural Yearbook Editing Committee，2011）。在太湖流域稻田，每年氮素综合使用量高达 500～600 kg∙hm-2（Zhao et al.，2012）。氮肥的过量施用产生了负面环境效应，如温室气体排放（Pearson et al.，1993；Krupa，2003）、土壤酸化（周细红等，2004）、板结和水体富营养化等（Bouwmeester et al.，1985），同时也可能导致土壤微生物群落组成与功能的改变（马冬云等，2007）。氮肥可以直接刺激相关功能微生物的生长，如氨氧化细菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）、亚硝酸氧化细菌（Lisa et al.，2016）等。此外，过量施肥导致的土壤性质变化作用于土壤微生物整体群落结构，会产生更为深远的生态环境影响。

土壤污染是中国农业生产面临的另一重要威胁。多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是一类具有“三致”毒性的稠合苯环结构有机物（周丽虹，2010），主要来自于煤、石油等化石燃料以及一些生物质的不完全燃烧（傅家谟等，1996）。中国 PAHs年排放量达 11.4万吨（Tao et al.，2009），土壤中PAHs的点位超标率达到1.4%（环境保护部等，2014），个别点位每千克土壤含PAHs可达数万微克（Wu et al.，2016）。多环芳烃对土壤生态系统具有广泛的影响，如引起动植物死亡与突变（Staffan et al.，2007；Sverdrup et al.，2002），抑制植物生长（Maliszewska et al.，2000）等，并与微生物发生复杂的相互作用，影响微生物的多样性、组成和生理功能（Sawulski et al.，2014；Demenezes et al.，2012），同时被微生物降解（Fuchs et al.，2011；吴宇澄等，2013）等。

受施肥和污染排放的影响，一些农田土壤可能同时出现过量氮输入和PAHs污染。尽管有关其各自的微生物效应已有不少报道，但对两者叠加情况下的土壤微生物群落响应仍缺乏研究。本研究分别选择尿素和苯并[a]蒽（benz[a]anthracene，BaA）为氮肥和PAHs的代表，模拟土壤中过量施用尿素以及高浓度的BaA污染，设置土壤微宇宙试验，在测定尿素和苯并[a]蒽转化的基础上，采用高通量测序和定量 PCR方法深入解析添加污染物及施肥之后土壤细菌群落的丰度、多样性以及组成变化，结果有助于阐明农田土壤中多环芳烃和铵态氮肥的复合效应，并为探究有机污染物和氮转化间的交互作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样于2016年4月进行。供试土壤采自南京市郊某冶金企业附近的蔬菜地，采用五点采样法采集土样后充分混匀为1个混合土样，基本理化性质为：pH 6.5，有机质2.47%，总氮1.39 g∙kg-1，铵态氮 5.8 mg∙kg-1，硝态氮 6.4 mg∙kg-1，15 种优控 PAHs总量922 µg∙kg-1。土样经风干磨细后用于微宇宙培养试验。

1.2 微宇宙试验

微宇宙试验：120 mL血清瓶中装入30 g土壤（干质量），调节土壤含水量为田间持水量的60%，于黑暗的环境中（28 ℃）培养。共设置4个处理：对照处理（CK）、只添加苯并[a]蒽（A）、只添加尿素（N）、添加苯并[a]蒽和尿素（NA）。苯并[a]蒽和尿素的最终质量分数分别为100 mg∙kg-1和56 mg∙kg-1，在培养的第28天和第56天补充等N量的尿素。每个处理设置9个重复，在培养的第28天、第56天以及第84天进行破坏性取样（每个处理每次各 3个）。土壤经处理后，一部分用于 pH及无机氮测定，一部分提取DNA后用于下游分子生态分析。

同时设置一组平行土壤微宇宙试验，通过测定[7,12-14C]苯并[a]蒽（American Radiolabeled Chemicals，Inc.）的矿化量表征污染物的转化率。设置2个处理：只添加苯并[a]蒽（A），同时添加尿素和苯并[a]蒽（NA），其中苯并[a]蒽为14C和未标记的苯并[a]蒽混合物，土壤中污染物和尿素的终浓度及含水量同上所述，[7,12-14C]苯并[a]蒽添加量为2.2×105dpi∙g-1，每个处理设置 3个平行。

1.3 土壤pH和硝态氮的测定

采用酸度计测定土壤 pH（水土比 5∶1）；用 2 mol∙L-1KCl溶液提取土壤无机氮，用VCl3将硝态氮还原为亚硝态氮后，采用Griess试剂法测定（Wu et al.，2013）。

1.4 多环芳烃矿化量测定

以1 mol·L-1NaOH溶液吸收CO2，采用液体闪烁计数法（Beckman-Coulter，USA）（Wang et al.，2017）测定14CO2量。每两周取样测试1次。

1.5 土壤DNA提取

采用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒（MP Biomedicals）提取土壤 DNA，微量分光光度计（NanoDrop 2000）和电泳法检测DNA的质量。为避免共提取的土壤腐殖质等杂质干扰 PCR反应，DNA提取液经10倍稀释后用于下游分析。

1.6 硝化微生物功能基因定量PCR分析

参照文献方法（Cebron et al.，2008），采用定量 PCR方法测定各样品细菌和古菌单加氧酶基因（amoA）的拷贝数。定量PCR标准品的制备方法为：克隆目标基因提取质粒后测定其浓度并计算拷贝数，进行梯度稀释后绘制标准曲线（拷贝数范围102～108μL-1），定量 PCR 曲线标准 R2＞0.99，扩增效率≥80%。

定量PCR采用Sybr Green方法。总反应体积为 20 μL，包含 10 μL TransStart Green qPCR SuperMix（全式金），2 μL土壤DNA和8 pmol引物。古菌amoA基因（引物序列：5’-ATG GTC TGG YTW AGA CG -3’和 5’-GCC ATC CAB CKR TAN GTC CA-3’）反应程序为：95 ℃预变性 3 min，95 ℃45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s并读取荧光信号，38个循环；细菌amoA基因（引物序列：5′-GGG GTT TCT ACT GGT GGT-3′和 5′-CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC-3′）反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 45 s，53 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 30 s并读取荧光信号，36个循环。随后进行熔解曲线分析，采用电泳分析评价其扩增单一性。

1.7 细菌16S rRNA基因高通量测序及数据分析

采用通用引物 519F和 907R（引物序列：5′-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3′5′-TTACGACTT-3′）扩增细菌16S rRNA基因片段，其中正向引物序列中包含 5 bp的条形码（barcode）序列。PCR反应体积为50 μL，包括25 μL Taq DNA聚合酶预混液（Takara），1 μL模板（约50 ng基因组 DNA），1 μL正向及反向引物，23 μL ddH2O。PCR扩增条件为 95 ℃ 3 min，95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃60 s，35个循环。PCR产物经纯化后构建测序文库，采用Illumina MiSeq系统进行双向高通量测序（上海美吉）。

1.8 数据分析

基于QIIME分析平台进行高通量数据分析。序列经拼接、比对后在97%相似性水平划分操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），以此为基础计算多样性指数和非度量多维尺度分析（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）。运用R软件（vegan数据包）计算细菌群落之间的布雷距离（Bray distance），采用SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析（ANOVA）和多重比较，用Graphpad Prism 5作图。图表中数据均为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 土壤硝化和污染物矿化

随着培养的进行，4个处理微宇宙试验都出现明显的 NO3--N积累（图 1A）。两个添加尿素的处理（N和NA）硝态氮上升幅度更大，pH降低约1个单位，提示土壤硝化导致土壤酸化（图1B）。在84 d时，NA处理相对于N处理硝态氮增加缓慢，同时加入BaA（A和NA）处理相对于不加的处理（CK和N）土壤pH下降幅度有所减小。

培养过程中，14CO2持续积累，84 d矿化量约为10%（图1C）。添加尿素与否对土壤中BaA的矿化没有显著影响。

2.2 硝化微生物功能基因丰度

定量PCR检测中，硝化微生物功能基因扩增产物经熔解曲线分析和电泳分析为单一峰（条带），表明扩增不受引物二聚体或者非特异扩增影响。所有处理中，细菌 amoA基因拷贝数为1.2×107～5.6×107copies·g-1，古菌 amoA 基因拷贝数为 3.0×106～1.3×107copies·g-1。

不添加尿素的CK和A处理中，细菌amoA基因拷贝数无显著变化，N处理在28 d时显著升高而后呈现逐渐下降趋势，NA处理在28 d和56 d持续升高，但在84 d大幅度下降（图2A）。在N和CK处理中，古菌amoA基因拷贝数未发生显著变化；但添加BaA后，虽然NA处理中AOA数量在28 d有所增加，但是到56 d和84 d后，NA和A处理中古菌amoA基因拷贝数显著降低，其中84 d NA处理中AOA的数量相比于CK，降低了63%。（图2B）。

2.3 土壤细菌多样性变化

Miseq测序中，38个样品一共获得962536条16S rRNA基因序列，单个样品的序列数为17795～38255，在 97%序列相似性水平获得 5236个OTU。每个样品随机抽样17700条做OTU表，在此基础上分析土壤细菌的群落组成与多样性。

与原始土壤相比较，84 d的培养导致CK处理中细菌多样性明显降低，BaA的加入则未对土壤微生物多样性指数产生影响。添加尿素的处理中，土壤细菌群落多样性显著下降，在培养84 d时下降趋势尤为明显，Chao1指数、观测到的物种数和香农指数等均显著降低（图3）。

图1 微宇宙培养过程中土壤量（A）、pH（B）以及苯并[a]蒽矿化率（C）的变化Fig. 1 Changes in NO3- (A), soil pH (B) and mineralization of benz[a]anthracene (C) during the incubation n=3

图2 培养过程中细菌（A）和古菌amoA基因（B）丰度的变化Fig. 2 Changes in the bacterial (A) and archaeal amoA gene copies (B) during the incubation

2.4 土壤细菌群落结构变化

随着培养的进行，土壤中细菌群落结构发生变化。NMDS分析（图4A）显示：28 d时，各处理土壤细菌群落相对聚集，未有明显区分；56 d起，添加尿素处理与不添加尿素处理形成了不同的细菌群落结构，N和NA处理与A和CK处理群落之间差异明显，但BaA对群落结构的影响相对较小；84 d时，细菌群落间的差异进一步增大。统计分析显示（图4B），培养28 d时，A、N及NA 3个处理与CK之间未有显著变化，到58 d加尿素处理中细菌群落结构已经与CK显著不同，而84 d时，各处理中细菌群落都有极显著变化且尿素的影响大于BaA。

在纲（Class）分类水平，土壤中相对丰度≥1%的主要细菌门类有14个（表1）。在此14个纲中，6个纲的相对丰度和土壤pH呈正相关关系，其中2个为显著相关，4个为极显著相关；4个纲和土壤pH均呈极显著负相关关系。此外，添加尿素显著增加了和土壤亚硝酸氧化相关的Nitrospirae的丰度（数据未显示）。这些结果表明，尿素很可能促进了相关的硝化微生物生长，但是土壤中细菌群落的整体变化则可能主要由尿素导致的pH变化引起。

表1 纲水平土壤细菌相对丰度和pH之间相关性分析Table 1 Correlation between dominant bacterial class and soil pH

图3 培养过程中土壤多样性指数变化：Chao1指数（A）、观测到的物种数（B）、香农指数（C）Fig. 3 Change of soil diversity index: Chao 1 (A), Observed species (B), Shannon (C)

图4 土壤细菌群落间的NMDS（A）和布雷距离分析（B）Fig. 4 NMDS (A) and bray_distance (B) analysis of soil bacteria communities

3 讨论

3.1 尿素的微生物生态效应

大量研究发现，使用铵态氮肥会出现明显的硝酸盐积累同时显著降低土壤pH（Phillip et al.，1997；Bouman et al.，1995；Dlana et al.，2008）。本研究中，添加尿素处理中出现的此类现象，究其原因为底物刺激导致的土壤硝化活性增加。硝化过程由氨氧化和亚硝酸氧化两个步骤组成，其中氨氧化过程主要由氨氧化细菌和氨氧化古菌完成（Lisa et al.，2016），它们受到土壤pH值的强烈影响（He et al.，2012）。由于供试土壤为中性，氨分子浓度较高，有利于氨氧化细菌的生长，反映为相应微宇宙中细菌amoA基因拷贝数的增加；在此环境下，氨氧化古菌可能居于竞争劣势（Zhang et al.，2012），而未出现明显增殖。

土壤pH直接影响着微生物的多样性和组成结构（Wu et al.，2016；Kateryna et al.，2015；Lauber et al.，2009）。在本研究中，随着培养的进行，尤其是56 d之后，添加尿素微宇宙土壤的pH明显降低，对土壤微生物群落产生了巨大的影响。一方面，这可能导致了培养后期硝化微生物丰度的降低（图2），另一方面改变了土壤中的优势微生物（表1）、降低了土壤微生物的多样性（图3），并进一步导致细菌群落的整体变化（图4）。土壤酸化不仅影响微生物，还会导致土壤有毒重金属离子活性增加、土壤肥力降低、结构变差以及影响作物生长发育等一系列问题（Sutradhar et al.，2014；Baquy et al.，2017；Lofton et al.，2010）。本研究所模拟的施氮量与目前太湖流域部分稻田的综合施肥量相近（Zhao et al.，2012），因此，过量施用氮肥导致的土壤生态风险不可忽视。

3.2 苯并[a]蒽的微生物生态效应

有研究发现，高浓度的多环芳烃污染能显著改变土壤微生物的多样性（吴宇澄等，2016）、群落组成和生理活性（Sawulski et al.，2014；Demenezes et al.，2012）。对本研究采样区的原位调查结果显示（Wu et al.，2016；Wu et al.，2017），与 PAHs污染相比，pH是更重要的土壤微生物群落结构决定因素。本研究通过微宇宙培养所获得的结果与原位调查相似，初始质量分数为 100 mg∙kg-1的 BaA对土壤微生物多样性和微生物群落结构的影响相对较小。分析其原因，可能是由于BaA的矿化率只有10%左右（图1C），更多的污染物还是以各种形态存在于土壤中，而BaA是一种疏水性污染物，与土壤基质发生结合后，生物有效性降低。但是，长期PAHs作用的微生物群落效应依然存在。本研究中，84 d时CK与A处理下的细菌群落产生了较明显的分离（图4）。虽然目前这种改变的机制尚不清楚，但有文献报道，PAHs对微生物具有选择性（吴宇澄等，2016），导致降解功能细菌的富集与敏感细菌的下降（Cebron et al.，2008；Chen et al.，2015；Bengtsson et al.，2013）；此外，许多PAHs降解的中间产物可能具有更高的生物毒性（Staffan et al.，2007），如我们发现BaA的降解中间产物苯并[a]蒽醌对一类氨氧化古菌有更强的抑制效果（Dai et al.，2018），这些中间产物也会形成一定的生态风险。考虑到 PAHs类污染物种类的多样与土壤的复杂性，需进一步探究PAHs的土壤微生物生态效应。

3.3 尿素和苯并[a]蒽对土壤微生物的交互作用

尿素和苯并[a]蒽的转化均是微生物作用的结果。土壤中氮循环和污染物降解过程是否存在相互作用，是污染生态学和污染土壤修复研究关注的重要科学问题。CO2是PAHs转化的最终形态，是污染土壤修复的最理想状态，矿化率是土壤中 PAHs修复效果的重要指标。一般而言，PAHs矿化率越高，表明解毒效果越好。本研究中，添加尿素未对BaA的矿化率产生显著影响。分析其原因，可能是由于供试土壤本身的理化性质、结构特征导致尿素或者硝化过程对 BaA的矿化影响本身就较小（Kästner et al.，1998）。但有研究发现，弱酸能够显著促进土壤中 PAHs的矿化（Bhabananda et al.，2017），硝化微生物（AOA）具有降解芳香性污染物的能力（Men et al.，2016）。在不同的土壤中，由于受微生物群落、土壤化学性质、物理结构以及尿素和 PAHs的浓度等因素影响，尿素是否影响PAHs的矿化还有待更深入的研究。

此外，供试土壤有较长的PAHs污染历史（Wu et al.，2016），这可能导致土壤硝化微生物产生抗性从而产生适应性（Griffiths et al.，2013），故添加BaA后，本研究未像其他研究（Cheng et al.，2014）一样出现土壤硝化活性的显著降低。但是，100 mg∙kg-1的BaA显著降低了土壤中古菌amoA基因拷贝数，并减缓了土壤硝化过程伴随的土壤酸化。由此推测，BaA可能对土壤中尿素的硝化产生影响，这与我们此前观察到PAHs对氨氧化古菌的抑制效应一致。

4 结论

本研究探究了尿素和苯并[a]蒽对农田土壤微生物群落的生态效应。结果显示，尿素显著刺激土壤硝化活性和硝化细菌生长，降低土壤 pH，并通过土壤酸化对微生物群落产生极大影响；苯并[a]蒽有抑制土壤硝化、改变土壤微生物组成和结构的潜在趋势，但作用相对较小；受试土壤中，尿素虽未抑制苯并[a]蒽的矿化，但苯并[a]蒽抑制了土壤中硝化古菌的生长，且减缓了硝化过程伴随的土壤pH降低。鉴于土壤间存在的理化性质和微生物群落差异，还需更深入地研究施肥和有机污染物的土壤生态效应及其相互作用。

致谢：感谢南京大学季荣教授对于本研究中多环芳烃矿化分析的大力支持！