Box-Benhken响应面法优化微波提取黄精总皂苷的条件△

赵丽蓉，罗汉，相英龙，孙慧娟，梅桂林，方成武，*

(1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800)

黄精为百合科植物滇黄精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.、黄精PolygonatumsibiricumRed.或多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根茎[1]。始载于《名医别录》，黄精入药性平而润，味甘而淡，无毒而杀虫[2]；其功能补气养阴，健脾，润肺，益肾。用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足等[1]。目前临床上多用于治疗糖尿病，冠心病，白细胞减少等症。现代药理研究表明，黄精可降血糖，降血脂，能有效改善心血管功能，增强免疫力以及延缓衰老[3]。

目前考察黄精总皂苷的提取工艺中大多采用超声法、回流法，优化方式多采用正交试验法。微波辅助提取法是近年来兴起的提取方法，具有加热速度快，提取时间较短，提取效率高等优点[4]。并且响应面优化方法相对于传统的正交法，可以更加系统全面的考察因素与因素之间，因素与响应面之间的交互作用[5]。有关Box-Benhken响应面法优化微波提取黄精总皂苷的提取工艺的文献尚未报道，因此本研究采用单因素与响应面优化相结合的方法，以黄精总皂苷得率为指标，考察最佳提取条件，以期为黄精质量评价提供参考依据，同时也为黄精资源的开发利用提供理论基础。

1 仪器与试药

UV-2012C紫外-可见分光光度(上海皖宁精密科学仪器有限公司)；UPC-50实验室专用超超纯水机(北京康铭时代环保科技有限公司)；JP-031B 超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；C型-800Y打粉机(南京威利朗食品机械有限公司)；4-20R通用离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)；美的M3-L239C微波炉(广东美的厨房电器制造有限公司)；FA2004万分之一电子天平(上海上平仪器有限公司)；HWS-24恒温水浴锅(上海一恒有限公司)。乙醇、甲醇、冰醋酸、高氯酸等试剂均为分析纯。

菝葜皂苷元对照品(批号：126-19-2)、人参皂苷Rb1对照品对照品(批号：41753-43-9)，购于南京元宝峰医药科技有限公司；薯蓣皂苷元(批号：512-04-9)，购于上海源叶生物科技有限公司。黄精样品采自2017年5月湖南岳阳市，经安徽中医药大学王德群教授鉴定为百合科植物多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根茎。

2 溶液的配制

2.1 对照品溶液的制备

精密称取菝葜皂苷元对照品2.0 mg，用甲醇定容至置10 mL容量瓶中，配得对照品浓度为0.2 mg·mL-1；精密称取薯蓣皂苷元对照品2.5 mg，用甲醇定容至置10 mL容量瓶中，配得对照品浓度为0.25 mg·mL-1；精密称取人参皂苷Rb1对照品10.0 mg，用甲醇定容至置10 mL容量瓶中，配得对照品浓度为1 mg·mL-1。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取黄精粉末1 g(过四号筛)，置100 mL锥形瓶中，加入50%乙醇16 mL，振摇均匀后放入微波炉，设置390 W的功率，间歇式微波提取40 S，平均每10 S拿出冷却后再次进行微波提取。抽滤后用50%乙醇洗涤3次，合并滤液与洗涤液，用50%乙醇定容在25 mL容量瓶中，作为供试品溶液。

3 方法

3.1 波长的选择

分别精密吸取薯蓣皂苷元对照品溶液和人参皂苷Rb1对照品溶液各250 μL，菝葜皂苷元对照品溶液500 μL和供试品溶液250 μL置于具塞试管内，在60 ℃水浴条件下挥干，加入新鲜配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，在冰浴条件下加入0.8 mL高氯酸，摇匀后在60 ℃水浴条件显色20 min， 冷却2 min后加入5 mL冰醋酸，摇匀后静置，在200～800 nm条件下进行全波长扫描。空白对照为甲醇，同条件下显色。

3.2 标准曲线的配制

分别精密吸取菝葜皂苷元标准品0.1、0.2、0.3、0.35、0.4 mL置具塞试管中，在60 ℃水浴条件下挥干，按3.1项下的显色方法进行显色。在460 nm下测量吸光度。以进样质量为横坐标，以吸光度为纵坐标建立标准曲线。空白对照为甲醇。

3.3 微波提取黄精总皂苷的单因素实验

通过前期查阅文献以及预实验，最终确定考察乙醇浓度，提取时间，料液比，微波功率四个因素，按上述条件进行样品制备。1)固定提取时间为40 s，微波功率为390 W，料液比为1∶16，设置乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%五个水平；2)固定乙醇浓度为50%，料液比为1∶16，微波功率为390 W，设置提取时间为20、30、40、50、60 s五个水平；3)固定乙醇浓度为50%，提取时间为40 s，波功率为390 W，设置料液比为1∶8，1∶12，1∶16，1∶20，1∶24五个水平；4)固定乙醇浓度为50%，提取时间为40 s，料液比为1∶16，设置微波功率为90、240、390、550、700 W五个水平。

3.4 响应面法优化黄精总皂苷的提取方法

在单因素实验基础上，选择乙醇浓度，提取时间，料液比三个因素为自变量，黄精总皂苷得率为因变量，用响应面法设计三因素三水平的中心组合实验，以优化黄精总皂苷的提取方法。因素水平表见表1。

推荐理由:《中国传统镂版印花工艺研究》不仅是我国手工印染工艺领域有关“中国传统镂版印花”的第一本专著，填补空白的价值与意义十分突出，而且也是我国传统镂版印花工艺类非物质文化遗产研究的重要成果之一。这是作者历时八年用双脚行万里路获取的第一手资料、精心整理分析研究而撰写的专著。作者师从中国著名设计理论家、教育家雷圭元教授，清华大学美术学院贾京生教授为本书写序。

4 结果与分析

4.1 黄精皂苷提取方法的确立

4.1.1 波长的选择 经全波长扫描得出菝葜皂苷元最大吸收波长为460 nm，薯蓣皂苷元为540 nm，人参皂苷Rb1为550 nm，黄精皂苷样品为460 nm左右，结果显示，菝葜皂苷元与样品的最大吸收波长一致，因此选用菝葜皂苷元作为对照品。结果如图1所示。

注：A.薯蓣皂苷元；B.人参皂苷Rb1；C.菝葜皂苷元；D.样品。图1 对照品及样品补偿扫描图

4.1.2 标准曲线 选用菝葜皂苷元标准品绘制标准曲线，所得线性回归方程为Y=1.781 8X-0.079 2，相关系数r=0.999.表明线性关系良好。

4.2 单因素实验结果与分析

4.2.1 乙醇浓度对黄精皂苷提取率的影响 如图2所示，固定其他条件不变，黄精总皂苷的得率随乙醇浓度的增大而增大，当增加到50%时，总皂苷得率达到最大值，当乙醇浓度超过50%时，总皂苷得率随乙醇浓度的增大而减小。其原因可能是微波提取相对于其他提取法，在较短时间内达到预定温度，而乙醇浓度越高溶剂的沸点越低，达到预定温度的时间越短，平衡加热的时间也就越长。在大于50%的浓度条件下，总皂苷提取率较高。因此选用50%的乙醇浓度作为最佳提取浓度。

图2 乙醇浓度对黄精总皂苷得率的影响

4.2.2 提取时间对黄精总皂苷提取率的影响 如图3所示，固定其他条件不变，在20～40 s的微波时间内黄精总皂苷的得率逐渐增大，在超过40 s的提取时间内黄精总皂苷的得率逐渐减小。原因可能是微波加热的时间过长，导致黄精总皂苷的结构成分改变，得率因此降低。所以选用40 s作为最佳提取时间。

图3 提取时间对黄精总皂苷得率的影响

4.2.3 料液比对黄精总皂苷提取率的影响 如图4所示，固定其他条件不变，料液比在1∶8～1∶24范围内，在1∶16时黄精总皂苷得率达到最大值。原因可能是当料液比较低时黄精总皂苷的溶液达到饱和，提取率不完全所致；当料液比增大时，结果表明皂苷得率波动不大，对提取率的影响不大，反而增加了浓缩时间。因此选用料液比为1∶16时较为合适。

图4 料液比对黄精总皂苷得率的影响

4.2.4 微波功率对黄精总皂苷提取率的影响 如图5所示，固定其他条件不变，设置微波功率范围为90～700 W，当功率在390 W时，黄精总皂苷得率达到最大值，其他功率皂苷得率都有降低。分析原因可能是随着微波功率的增大，电磁波发射出的频率越大，物质内部产生的热能越大，皂苷溶质逐渐溶出。提取率逐渐增大；而功率过高，有效成分破坏，提取率逐渐减小。综合考虑，选用390 W作为最佳提取功率。

图5 微波功率对黄精总皂苷得率的影响

4.3 响应面法实验结果与分析

根据单因素结果，选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)三个因素进行Box-Benhken响应面优化，其中1～12组实验为析因设计，13～17组实验为中心设计；零点实验共设计五组，用以估算实验误差。响应面设计以A、B、C为自变量，以总皂苷得率(Y)为因变量，设计方案如表2所示。

对表2中的数据进行回归分析，得出回归方程为Y=3.72-0.2A-0.074B-0.067C-2.5AB-0.03AC+ 0.01BC-0.91A2-0.62B2-0.77C2并作出响应面图和等值线图。对该模型进行响应面分析，得出二次响应回归模型的方差分析，分析结果如表3所示。

由方差分析结果可见，该模型的显著型检验中F=383.63，P<0.01表明该模型具有统计学意义；而在失拟项中F=383.63，P>0.05表明失拟项无统计学意义。且该模型的校正决定性系数RAdj2=0.9954，表明该实验模型对本实验的拟合度较好，能够较好的反映提取时间、乙醇浓度、料液比三个因素对黄精总皂苷得率的影响。另外，分析结果中，回归方程的一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2的P值均小于0.05或0.01，说明各个因素对结果的影响不是简单的线性关系。由F值可知A>B>C，表明各单因素对实验结果的影响顺序为：乙醇浓度>料液比>提取时间[6-8]。

采用Design-Expert.8.0 软件对结果进行响应面分析，结果如图6～8。

图6 乙醇浓度与提取时间的响应面与等值线

图7 乙醇浓度与料液比的响应面与等值线

图8 料液比与提取时间的响应面与等值线

图6～8表示当A、B、C中任意一个因素变为0时，其他两个因素对提取率的影响以及交互作用。由图6可知，固定料液比不变时，黄精总皂苷得率随乙醇浓度和提取时间的增大而增大，当乙醇浓度范围在38%～58%， 提取时间范围在28～50 s 时，总皂苷含量最大，超过此范围含量降低；由图7可知，固定提取时间不变时，黄精总皂苷得率随乙醇浓度和料液比的增大而增大，当乙醇浓度范围在38%～58%，料液比范围在1∶11～1∶21时，总皂苷含量最大，超过此范围含量降低；由图8可知，固定乙醇浓度不变时，黄精总皂苷得率随料液比和提取时间的增大而增大，当料液比范围在1∶13～1∶19时，提取时间范围在29～49 s，总皂苷含量最大，超过此范围含量降低[9-10]。

经Design-Expert.8.0 软件分析，黄精总皂苷最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为50%，料液比为1∶16，提取时间为40 s。预测值为3.72%。

4.4 验证实验

基于上述分析结果得出的最佳提取工艺，进行微波提取黄精总皂苷，平行三次实验。三次实验所得结果的平均值为3.70%，与模拟预测值接近。说明该模型优选出的最佳提取工艺真实可靠，具有实际意义。

5 讨论

本实验以紫外分光光度法为检测手段，考察了微波提取黄精总皂苷的最佳工艺，以香草醛-冰醋酸法进行显色。将薯蓣皂苷元、菝葜皂苷元、人参皂苷Rb1三种标准品与黄精样品的最大吸收波长进行对比，确定以菝葜皂苷元作为对照品；根据单因素实验结果，确定乙醇浓度、提取时间、料液比三个因素进行三水平三因素的响应面优化，最后用Design-Expert.8.0 软件对结果进行分析。优选出最佳提取工艺为乙醇浓度为50%，料液比为1∶16，提取时间为40 s。方差分析结果表明：该模型对本实验的拟合度较好，可以较为准确的预测结果，具有实际意义。

致谢：本次实验所用黄精药材由王德群教授的学生彭星星于2017年5月采自湖南岳阳市，特此感谢。