重组腐败梭菌α毒素对兔的免疫效力分析

陈小云，刘 莹，薛 麒，朱 真，李启红，印春生，姚文生，康 凯，杜吉革

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

腐败梭菌是一种能够引起人以及牛、羊、马、猪、水貂、鸡等多种动物发病的厌氧菌[1-6]，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大[7-8]。本菌的主要感染途径是创伤感染，从而引起机体的恶性水肿。此外，腐败梭菌可通过消化道感染机体，引起一种非接触性的急性致死性传染病[7]。目前，通过灭活腐败梭菌培养物上清而制备的天然类毒素疫苗是预防该菌感染的主要疫苗，但该类疫苗制备过程繁琐，抗原成分复杂，有效抗原含量较低。因此，筛选纯净有效的抗原用于研制新型腐败梭菌病疫苗，对未来预防该菌感染具有重要意义。

腐败梭菌能产生4种主要外毒素，分别为α、β、γ以及δ[9-12]。其中，α毒素被证明是一种关键的致死性毒力因子，并且与致病性有直接的关系[13-17]。该毒素以相对分子质量46～48 ku的低活性或无活性的前体毒素形式分泌后，前体毒素可在蛋白酶的活性作用下水解掉C 端45个氨基酸，形成活化形式[18-19]。α毒素具有溶血、细胞毒性、坏死和致死等生物活性[14-17]，对常见实验用细胞(如CHO、Vero、MDCK)和人的上皮细胞等均有毒性[20-22]。该毒素在37 ℃的条件下，经0.5%～0.8%的甲醛溶液处理3～6 d后即可成功脱毒成为类毒素[23]。张燕等[24]及彭国瑞[25]分别通过原核表达载体pQE30和pET28a表达腐败梭菌α毒素，结果发现重组α毒素大部分以包涵体的形式存在，且该蛋白对腐败梭菌天然毒素有一定的免疫保护作用。此外，彭国瑞等[23]的研究发现，少量可溶性的重组α毒素具有与天然毒素相似的细胞毒性和小鼠致死性等特性。然而，上述研究者均未对重组α毒素进行纯化，无法对重组毒素的免疫保护性和毒力进行准确定量。已有的研究发现，将目的基因按照大肠杆菌偏好的密码子进行优化后可明显提高目的蛋白的可溶性表达[26-29]。为此，作者对我国现行腐败梭菌灭活疫苗的制苗用菌株(C55-1株)α毒素的编码基因按大肠杆菌偏爱的密码子进行了优化设计和人工合成，通过原核系统表达后进行纯化，并对其纯化蛋白的毒力以及免疫原性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

腐败梭菌C55-1株(CVCC60021)、腐败梭菌C55-1株天然毒素、腐败梭菌抗血清(兔源)、犬肾细胞(MDCK细胞)以及pET-30a(+)(简称pET)表达载体均为本实验室保存；1.5～2.0 kg普通级健康日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受态细胞Top10和BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；Montanide ISA 201佐剂购自法国赛彼科(Seppic)公司；Ni-IDA亲和层析介质试剂盒、蛋白Marker、Western blot Marker均购自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)购自东洋坊公司；premixTaqversion 2.0、DNA Marker购自TaKaRa公司。T4连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自Promaga公司；限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自NEB公司；抗His标签单抗、Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG以及山羊抗兔IgG均购自中山金桥公司。

1.2 基因合成及密码子优化

按大肠杆菌偏爱的密码子对已知的腐败梭菌C55-1株α毒素编码基因进行优化设计[25]，并在该基因后添加6*His标签蛋白编码序列。由中美泰和公司人工合成基因片段Gcsa。

1.3 重组α毒素原核表达载体的构建

以Gcsa基因为模板，采用引物对csa-F/csa-R进行PCR扩增。其中上游引物csa-F序列：5′-CGCGAATCCATGACTAATCTGGAG-3′，其5′端引入限制性内切酶BamHⅠ位点(下划线部分)及保护性碱基；下游引物csa-R序列：5′-CCGAAGCTTTTAGTGGTGATGATG-3′，其5′端引入限制性内切酶HindⅢ位点(下划线部分)及保护性碱基。PCR体系为50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 预变性4 min；98 ℃变性10 s，56℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，共33个循环；最后68 ℃延伸7 min。

回收扩增得到的DNA条带，采用BamHⅠ/HindⅢ双酶切消化后，与经过相同酶切消化的pET-30a(+)载体连接。将连接好的质粒转化Top10感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，提取质粒。对所提质粒进行PCR和双酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的质粒送中美泰和公司测序，测序正确的质粒命名为pcsa。

1.4 重组蛋白的表达与鉴定

将质粒pcsa和空载体pET分别转化BL21(DE3)感受态细胞，并分别在15和37 ℃的条件下用IPTG诱导表达，收集菌体，超声破碎后分别收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况及其可溶性，并以BSA蛋白为标准，利用灰度扫描的方法进行相对表达量和可溶性比例的统计，将表达的重组蛋白称为rCSA。采用Western blot方法，以抗His标签蛋白抗体为一抗，对重组蛋白进行进一步的鉴定。

1.5 重组蛋白的纯化及Western blot鉴定

按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的重组蛋白进行纯化，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，-80 ℃保存备用。将纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，以腐败梭菌抗血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗进行孵育，按照底物显色试剂盒说明书进行显色，检测纯化的重组蛋白与腐败梭菌抗血清的反应情况。

1.6 重组蛋白的毒力测定

1.6.1 细胞毒力测定 将MDCK细胞接种96孔细胞培养板，置37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养至形成细胞单层后，弃细胞生长液。将纯化的rCSA及天然毒素用细胞维持液做10-1～10-10倍系列稀释，每个稀释度各接种3孔细胞，100 μL·孔-1，置37 ℃、 含5% CO2的培养箱中培养24 h，观察并记录细胞的病变情况。同时将胃肝肉酶消化汤和洗脱液用细胞维持液稀释100倍后，分别孵育细胞，作为阴性对照组。

1.6.2 小鼠毒力测定 已有的研究发现10 μg ·kg-1的天然腐败梭菌α毒素即可引起小鼠死亡[10]。本研究根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中的规定[30]，选择尾静脉注射的方法来检测重组蛋白对小鼠的毒力。将16～18 g ICR小鼠随机分组，每组5只。首先设置1.5、3和6 μg三个剂量梯度，根据小鼠的存活状况再进行倍比稀释。同时，设置蛋白洗脱液、肉肝胃酶消化汤两个阴性对照和1个小鼠MLD的天然毒素作为阳性对照。样品均用明胶缓冲液进行稀释，注射的液体总体积为200 μL，观察3 d，记录小鼠的存活状态。

1.7 免疫原性分析

1.7.1 重组蛋白的脱毒 用终浓度为0.8%的多聚甲醛溶液对rCSA进行脱毒，具体条件为37 ℃， 作用4 d。将脱毒后的rCSA以1.5、3和6 μg 的剂量静脉注射16～18 g ICR小鼠，观察3 d，以检测rCSA的脱毒效果。

1.7.2 免疫程序 将脱毒成功的rCSA与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例配制成rCSA终浓度为50 μg·mL-1的疫苗，另取灭菌PBS与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例制备对照疫苗，置4 ℃保存备用。选用体重1.5～2.0 kg健康家兔，并在免疫前测定每只家兔血清对腐败梭菌毒素的中和效价，取8只对腐败梭菌毒素的中和效价为0的家兔，其中4只颈部皮下注射疫苗，2.0 mL·只-1， 免疫后14 d，以相同剂量、相同途径进行第二次免疫。另外4只以相同剂量、相同途径和相同方法免疫对照疫苗作为对照组。

1.7.3 血清中和效价测定 在首免后14 d以及二免后21 d，分别对试验组及对照组所有家兔血清进行分离，并按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中规定的方法测定血清的中和抗体效价[30]。

1.7.4 毒素攻毒试验 二免后21 d，对免疫组及对照组所有家兔通过耳缘静脉各注射1个家兔MLD的腐败梭菌天然毒素进行攻毒，观察5 d，记录家兔的死亡情况。根据免疫组及对照组家兔的死亡情况，判定试验疫苗的免疫保护效力。

2 结 果

2.1 重组α毒素原核表达载体的构建

采用引物csa-F/csa-R进行PCR扩增，扩增片段经酶切后克隆至pET载体上。获得的重组质粒的双酶切电泳结果如图1所示，酶切后出现大小约5 kb的载体DNA片段，以及大小约1 260 bp的目的基因片段，与预期相符。测序结果表明，插入的外源基因序列正确，将此质粒命名为pcsa。

1. DL5000 DNA相对分子质量标准; 2. 重组质粒pcsa BamHⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定1. DL5000 DNA marker; 2. pET30a-Gcsa digested with BamHⅠ and HindⅢ图1 重组原核表达质粒pcsa的酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pcsa

2.2 重组α毒素的原核表达与鉴定

将pcsa以及pET分别转化BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示，表达的rCSA相对分子质量约为52 ku，大小与预期相符，rCSA在BL21(DE3)菌体中以可溶性和包涵体两种形式存在(图2)。图2a为rCSA表达的SDS-PAGE鉴定结果，如图所示，37 ℃、诱导4 h后，rCSA的表达量以及可溶性均优于其他诱导条件。以BSA蛋白为标准，利用灰度扫描计算得出rCSA相对表达量为30 mg·L-1，可溶比例为50%。为此，确定rCSA的最适诱导表达条件为37 ℃，IPTG诱导4 h，收获细胞裂解上清。图2b为rCSA的Western blot鉴定结果，如图所示，rCSA能与抗His标签抗体发生反应，证明rCSA含有His标签，与预期相符。

a.重组蛋白表达的SDS-PAGE鉴定；b.重组蛋白与抗His单抗反应的Western blot； M1. 蛋白质相对分子质量标准； M2. Western blot蛋白质相对分子质量标准；PC1. BSA (1 μg)；PC2. BSA (2 μg)； pET. pET 37 ℃、4 h诱导的细胞裂解物；1. pcsa，15 ℃、16 h诱导的细胞裂解物；2. pcsa，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解物；pET1. pET，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解上清；pET2. pET，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解沉淀；3. pcsa，15 ℃、16 h诱导的细胞裂解上清；4. pcsa，15 ℃、16 h诱导的细胞裂解沉淀；5. pcsa，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解上清；6. pcsa，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解沉淀a.The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b. The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot; M1. Protein marker; M2. Western blot marker；PC1. BSA (1 μg); PC2. BSA (2 μg); pET. The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 1. The cell lysates of pcsa induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 2. The cell lysates of pcsa induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; pET1. The supernatant of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; pET2. The precipitation of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 3.The supernatant of cell lysates of pcsa induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 4. The precipitation of cell lysates of pcsa induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 5. The supernatant of cell lysates of pcsa induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 6. The precipitation of cell lysates of pcsa induced with IPTG for 4 h at 37 ℃图2 rCSA的原核表达与鉴定Fig.2 Prokaryotic expression and identification of rCSA

2.3 rCSA的纯化与鉴定

如图3所示，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒说明书对rCSA进行纯化，收集纯度较高的洗脱液(50及500 mmol·L-1Imidazole的洗脱液)进行透析，最终获得的蛋白质质量浓度为1.5 mg·mL-1，纯度可达90%以上。将纯化后的rCSA经SDS-PAGE后转印到PVDF膜上进行Western blot检测。结果显示，rCSA能够与腐败梭菌抗血清发生反应(图4)。

2.4 rCSA的毒力测定

2.4.1 对MDCK细胞的毒力测定 MDCK细胞加入各组分后继续培养24 h，显微镜下观察。天然腐败梭菌α毒素各稀释度(10-2～10-4)以及rCSA各稀释度(10-4～10-7)接种细胞组出现了不同程度的细胞病变，且随着稀释度的增加，细胞的病变程度随之减弱。空白对照、肉肝胃酶消化汤和洗脱液对照组细胞生长良好。这说明0.15 ng·mL-1的蛋白即可引起MDCK细胞发生明显的细胞病变。

M. 蛋白质相对分子质量标准; 1.细胞裂解物上清；2.上清与Ni-IDA孵育后流出液；3. 20 mmol·L-1 Imidazole的洗脱液；4. 50 mmol·L-1 Imidazole的洗脱液；5. 500 mmol·L-1 Imidazole 的洗脱液M. Protein marker; 1. The supernatant of cell lysates after centrifugation; 2. The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant; 3. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 20 mmol·L-1 Imidazole); 4. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 50 mmol·L-1 Imidazole); 5. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 500 mmol·L-1 Imidazole)图3 rCSA的纯化Fig.3 Purification of rCSA

M. 蛋白质相对分子质量标准；1. pET 37 ℃、4 h诱导的细胞裂解物；2. 纯化后的rCSAM. Protein marker; 1. The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 2. rCSA after purification图4 rCSA与腐败梭菌抗血清反应的Western blot鉴定Fig.4 The identification of rCSA after purification with antitoxin serum of Clostridium septicum by Western blot

2.4.2 对小鼠的毒力测定 如表1所示，以1.5、3及6 μg的rCSA三个剂量注射组的5只小鼠在10 min之内全部死亡，随后，对1.5 μg的剂量组作2倍系列稀释，并测定各稀释度对小鼠的毒力。结果显示，0.046 88 μg的rCSA注射组的5只小鼠在3 d内全部死亡，而0.023 44 μg的rCSA注射组小鼠在3 d内死亡2只。为此，判定rCSA对ICR小鼠的MLD为1.302～1.465 μg·kg-1。

表1 样品的稀释方法以及小鼠存活情况

S.存活；D .死亡

S. Survived; D. Died

2.5 rCSA的免疫原性分析

2.5.1 抗rCSA兔血清的中和抗体效价测定 经多聚甲醛灭活的rCSA分别以1.5、3以及6 μg的剂量尾静脉注射小鼠，各组小鼠均存活(数据未显示)，说明rCSA已成功脱毒。以无毒力的rCSA制备疫苗免疫家兔后，血清中和抗体效价测定结果如表2所示，每毫升的一免抗血清可中和100～130个 小鼠MLD的腐败梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和360～480个小鼠MLD的腐败梭菌毒素，而佐剂对照组的兔血清对腐败梭菌毒素无中和作用。

2.5.2 攻毒保护性试验 在二免后21 d，对所有rCSA免疫组和佐剂免疫对照组的家兔，经耳缘静脉注射1个兔MLD的腐败梭菌天然毒素，结果佐剂免疫对照组家兔在攻毒后5 d内全部死亡，rCSA免疫组家兔全部健活，未见任何不良反应(表2)。

表2 抗rCSA的兔血清的中和抗体效价及rCSA的免疫保护结果

S.存活；D .死亡

S. Survived; D. Died

3 讨 论

基因工程亚单位疫苗研制的关键是免疫原的筛选与鉴定。因此，作为腐败梭菌最重要致死性毒力因子和保护性抗原[13-17]的α毒素，成为众多学者的研究对象。已有的研究发现，重组α毒素大部分以包涵体的形式存在[24-25]，而本研究对α毒素基因进行密码子优化后，通过pET30a成功表达了重组腐败梭菌α毒素，并使该重组蛋白的可溶性比例达到50%，利于大量生产和纯化。此外，本文获得的重组α毒素仍具有很强的细胞毒性和小鼠毒性，从而为α毒素致病分子机制的进一步研究提供了良好的实验材料。

由于腐败梭菌引起的疾病病程短促，如不及时对症治疗，动物会迅速死亡。因此，免疫接种是预防这类疫病最有效的途径。目前，我国已批准的商品化腐败梭菌病疫苗主要有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症四联灭活疫苗等，但该类疫苗均为天然毒素经甲醛脱毒后制备的类毒素疫苗，其生产过程中需采用肉肝胃酶消化汤等天然成分较多的培养基，难以保证批间一致性，易导致产毒不稳定。此外，其抗原成分复杂，有效抗原含量较低，导致各菌株的类毒素免疫剂量均较高，制备联苗后免疫剂量过大，容易引起动物的应激反应。如曾经广泛使用的“羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症四联灭活疫苗”，因免疫剂量为每只羊5 mL，现已难以被养殖户所接受。现行《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中规定，在此类疫苗检验中，抗腐败梭菌毒素的兔血清中和抗体效价达到10个小鼠MLD·mL-1即可判为合格。虽然该标准为疫苗的最低标准，但从中国兽医药品监察所历年的兽用生物制品监督检验结果来看，目前我国该类疫苗的免疫效力不容乐观，疫苗抽检不合格的情况时有发生(http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201504/t20150402_4472055.htm)。彭小兵等[31]对自2006年至2015年间的此类疫苗检验结果的统计发现，以血清中和法检验后效力不符合规定的产品共有33批，其中产气荚膜梭菌β毒素组分效力不符合规定的比例最高，约为72.7%。然而，鉴于此类联苗免疫剂量的限制，无法再大程度增加β类毒素的比例。为此，梭菌毒素亚单位疫苗的研制显得极为重要。在一定的范围内，我们可以最大幅度地增大免疫原性较差的毒素抗原(如β类毒素)，从而提高联苗的总体免疫保护作用。而本研究中制备的rCSA一免兔血清每毫升可中和100～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素，中和效价约为目前的商品化疫苗腐败梭菌部分的10～13倍，效果明显提高，从而为腐败梭菌以及梭菌类毒素基因工程类亚单位疫苗的研制提供了良好的候选抗原。

4 结 论

人工合成腐败梭菌α毒素基因片段Gcsa，将其克隆至pET-30a(+)进行表达与纯化，成功获得重组腐败梭菌α毒素——rCSA。rCSA为可溶性表达，比例可达50%，且能与腐败梭菌抗血清反应。0.15 ng·mL-1的rCSA即可在MDCK引起明显的细胞病变；rCSA对ICR小鼠的最小致死量是1.5×106ng·kg-1。rCSA经甲醛脱毒后制成疫苗免疫家兔，二免抗血清可中和360～480个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；rCSA免疫家兔能耐过1个家兔MLD的腐败梭菌毒素的攻毒。可见，rCSA具有良好的免疫原性，可作为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的候选抗原。