脾虚对哮喘大鼠脂质介质水平影响及捏脊法的干预效应研究❋

熊 英，樊 璞，沈楚楚，周瑞鹏，陈 骁

(南京中医药大学，南京 210023)

哮喘是儿童最常见的呼吸道疾病，包括过敏原在内的有害刺激诱发急性气道炎症而未能及时消退并转为慢性炎症，是哮喘的重要病理特征,这与哮喘患者体内存在内源性特异性促炎症消退介质(specialized proresolving mediators，SPMs)调控障碍、促炎介质水平升高密切相关[1]。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)是研究最多的一类SPMs，能有效对抗促炎介质的作用，促进哮喘急性炎症的消退[2]。

中医学认为，痰饮内伏是哮喘发生的内因，脾为生痰之源，为肺之母，小儿脾又常虚，所以脾虚是儿童哮喘的重要病理特点之一[3]。捏脊法是防治儿童哮喘的常用外治法，有较好的临床效果[4],但其机制尚未见深入研究。本研究旨在观察脾虚对哮喘大鼠脂质介质中前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)促炎介质及LXA4水平的影响以及捏脊法的干预效应，以期为捏脊法防治儿童哮喘提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级雄性SD大鼠44只，体质量(44.72±3.26) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(许可证号SCXK(沪)2007-0005)。普通饮食喂养，室温22±2 ℃，湿度50%～70%，光照适度，通风及洁净程度良好。将SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组8只，哮喘组、脾虚哮喘组、捏脊脾虚哮喘组各12只,大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 药物、试剂及仪器

脾虚造模所用中药材由南京中医药大学国医堂门诊部提供。中药冷水浸泡30 min，常规煎煮2次合并药液，浓缩至1 mL/g原药材。卵蛋白(OVA，Grade V，Sigma公司，货号A5503)，大鼠LXA4、CysLTs、PGE2酶联免疫(ELISA)试剂盒(由上海酶联生物科技有限公司提供)，Rayto RT-6100酶标分析仪、雾化器(江苏鱼跃器械有限公司)。

1.3 脾虚哮喘大鼠模型的建立(图1)

图1 脾虚哮喘大鼠模型建立流程

1.3.1 脾虚模型的建立 参考文献[5]方法建立脾虚模型。以厚朴、枳实、大黄按3∶3∶2的比例浓缩成100%煎剂,1 g/mL隔日灌胃1次,每次1.5 mL/100 g/体质量,喂药当日禁食不禁水,次日喂饲不限，喂养44 d。在脾虚造模结束时，造模大鼠出现体质量下降、食量减少、倦怠少动、饮水增多、肛温升高等症状，符合脾虚证标准。正常对照组和哮喘组以自来水灌胃。

1.3.2 哮喘模型的建立 参考文献[6]采用OVA致敏和激发方法建立哮喘模型，在脾虚造模完成后的第1天(实验第45天)和第8天(实验第52天)分别腹腔注射OVA/AL(OH)3混合液1.5 mL(内含OVA 1 mg, AL(OH)3凝胶1.5 mL) 致敏，脾虚造模后第15天(实验第59天)始定时给予1% OVA雾化器喷雾激发，每次30 min，连续3 d(实验第59～61天)。当激发时大鼠出现呼吸喘促、点头、腹肌抽动等呼吸困难症状，提示哮喘模型造模成功。正常对照组致敏与激发均以生理盐水代替OVA。

1.4 捏脊法干预

捏脊法操作：一助手以一只手轻抚按大鼠头部，另一手轻持鼠尾根部将大鼠固定。操作者先以一手四指腹面轻抚大鼠脊柱中央背部皮肤，从大椎至脊中线尾根部共3遍；而后以双手拇食指紧靠，轻轻对称提起大鼠背部沿中线两侧的皮肤，以指腹相对用力，从脊中线尾根部一直捏至大椎穴处共7遍，接着用四指齐捏背部中线两侧皮肤，从尾根部至大椎穴捏三提一，重点在肺俞、脾俞共3遍，力量以大鼠不尖叫且较平静为度。操作中涉及的穴位按《实验针灸学》[7]比照人体穴位选取。捏脊法干预从实验的第10天始，持续到哮喘造模OVA激发前的第58天，其中OVA致敏前为每周一三五日各操作1次，OVA致敏期间的2周为每日操作1次。

1.5 大鼠体质量变化趋势及一般状态观察

脾虚造模过程中，观察大鼠体质量变化、食量、饮水量和肛温的变化及活动情况等，哮喘造模时观察大鼠呼吸频率、腹肌运动情况等。

1.6 大鼠肺组织病理学观察

除正常对照组在生理盐水末次激发后18 h随机选取6只取材，其余每组在OVA末次激发后按随机数字表法分为18 h和42 h组，每个时间段6只，25%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，迅速开胸、结扎并取出右肺上叶，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片、HE染色，光镜下观察。

1.7 ELISA检测大鼠肺泡灌洗液中LXA4、PGE2、CysLTs水平

25%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，开胸结扎右肺叶后，将灌胃针连接于注射器，将2.5 mL生理盐水缓慢注入气管和左侧肺中，立即缓慢抽回，再将所得液体缓缓注回肺内，如此反复3次，最后1次边回抽边将注射器缓缓拔出，将灌洗液盛入塑料离心管，此为第1次灌洗，然后重复3次上述操作，并将离心管置于冰盒中。然后以4 ℃、2000 r/min离心10 min，取上清液进行ELISA检测，检测严格按照相应试剂盒说明进行，测定吸光度值并换算成浓度水平。

1.8 统计学方法

图2 各组大鼠体质量增长趋势比较

2 结果

2.1 各组大鼠体质量增长趋势比较

图2显示，从实验整个过程的体质量变化趋势来看，脾虚哮喘组和捏脊脾虚哮喘组体质量增长速度显著缓于正常对照组(P<0.01)，捏脊脾虚哮喘组体质量增长速度显著优于脾虚哮喘组(P<0.05)。在哮喘造模结束时(第9周)，哮喘组体质量较正常对照组有显著下降(P<0.01)，捏脊脾虚哮喘组体质量显著高于脾虚哮喘组(P<0.05)。

2.2 各组大鼠肺组织病理学变化

图3显示，正常对照组可见支气管管壁和伴行动脉周围有稍许炎性细胞浸润，支气管管腔光滑，无炎性分泌物。哮喘组(18 h后)气道壁变粗，气道平滑肌增厚，支气管管壁和伴行动脉周围有较多的炎性细胞浸润，杯状细胞增生，气道腔内可见炎性分泌物；哮喘组(42 h后)相对于哮喘组(18 h后)气道管壁和动脉周围炎性细胞浸润有所减轻，炎性分泌物有所减少。脾虚哮喘组(18 h后)炎性细胞浸润比哮喘组(18 h后)更显著，支气管管壁显著增厚，炎性分泌物增多；脾虚哮喘组(42 h后)与脾虚哮喘组(18 h后)比较，炎性程度变化不明显。捏脊脾虚哮喘组(18 h后)的炎性病理变化程度比脾虚哮喘组减轻，与哮喘组相似；捏脊脾虚哮喘组(42 h后)的气道管壁厚度及其动脉周围炎性细胞浸润的程度比捏脊脾虚哮喘组(18 h后)有所减轻。

图3 肺组织HE染色比较(哮喘造模后18和42 h) (×200)

2.3 各组大鼠BALF中PGE2、CysLTs和LXA4水平的变化

表1显示，与正常对照组比较，在哮喘造模结束后18 h和42 h，哮喘组、脾虚哮喘组和捏脊脾虚哮喘组的PGE2水平均明显上升(P<0.01)，且42 h水平均显著高于18 h(P<0.01)。与哮喘组比较，在哮喘造模结束后18 h，脾虚哮喘组和捏脊脾虚哮喘组PGE2水平均显著上升(P<0.01)；在42 h时，脾虚哮喘组水平仍显著升高(P<0.01)，而捏脊脾虚哮喘组水平升高不显著(P>0.05)，且显著低于脾虚哮喘组(P<0.01)。与正常对照组比较，哮喘组、脾虚哮喘组和捏脊脾虚哮喘组的CysLTs水平均明显上升(P<0.01)，且42 h水平显著高于18 h时(P<0.01)；但脾虚哮喘组、捏脊脾虚哮喘组和哮喘组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组BALF中各脂质介质水平变化比较

注：与正常对照组比较：△△P<0.01；与哮喘组(18 h后)比较：▼▼P<0.01；与脾虚哮喘组(18 h后)比较：＊＊P<0.01；与哮喘组(42 h后)比较：☆☆P<0.01,☆P<0.05；与脾虚哮喘组(42 h后)比较：★★P<0.01,★P<0.05；与捏脊脾虚哮喘组(18 h后)比较：◇◇P<0.01

与正常对照组比较，在哮喘造模结束后，哮喘组、脾虚哮喘组和捏脊脾虚哮喘组的LXA4水平上升显著(P<0.01)，且42 h时水平均显著高于18 h时(P<0.01)，哮喘组LXA4/CysLTs比值虽有下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。在哮喘造模结束后42 h时，脾虚哮喘组LXA4水平显著低于哮喘组和捏脊脾虚哮喘组(P<0.05，P<0.01)，LXA4/CysLTs比值显著低于哮喘组和捏脊脾虚哮喘组(P<0.01，P<0.05)，且显著低于18 h；捏脊脾虚哮喘组LXA4水平高于哮喘组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

LXA4是SPMs中研究最多的一类，广泛表达于上皮细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等，能限制或阻止中性粒细胞的浸润，对抗调节PGE2和CysLTs，因此与哮喘密切相关，并能调节细胞因子，有助于哮喘的炎症消退[2]。研究显示，哮喘患儿有系统性和气管组织的LXA4水平明显下降[8]，严重哮喘患者的外周血和BALF中LXA4水平下降，LXA4/CysLTs的比例明显下降[9]。本研究结果显示，哮喘大鼠肺部出现炎症的同时，LXA4与CysLTs、PGE2水平均明显升高，而LXA4/CysLTs的比值虽有所降低，但差异无统计学意义，且随着LXA4水平的升高，哮喘炎症有缓解的趋势。但脾虚使哮喘大鼠的CysLTs、PGE2水平更显著升高，虽LXA4水平也在升高，但其升高幅度受影响，因此LXA4/CysLTs的比值显著下降，哮喘的炎症程度加重。与肺组织病理表现结合来看，本研究提示脾虚可能导致炎症消退的延迟。

中医学认为脾为生痰之源，肺为贮痰之器，脾失健运、痰饮内生、伏藏于肺成为哮喘的夙根。且小儿脾常虚，脾为肺之母，脾土不足也常累及肺，所以脾虚是儿童哮喘的重要病理特点之一[3]。近年研究显示，脾虚动物模型和患者多存在慢性炎症[10]，结合此研究的结果提示脾虚可能影响炎症的消退导致“伏痰”的产生，成为哮喘发生的重要病理机制。

捏脊法是以中医理论为指导，运用捏、提、捻、推手法刺激人体背部皮肤，从而防治疾病的一种外治方法。捏脊法主要循督脉和足太阳膀胱经操作，有调阴阳、培元气、和脏腑的作用，尤善健脾[11]，故又被称为“捏积法”。捏脊法由于易被儿童和家长所接受，也是中医防治儿童哮喘的常用干预手段，有较好的临床效果[4]。本研究结果显示，捏脊法不但有助于改善脾虚体质量增长缓慢的状况，而且有助于明显提升脾虚哮喘LXA4水平，降低CysLTs、PGE2水平，使LXA4/CysLTs的比值显著上升，有助于缓解肺部炎症。有研究表明，捏脊法可降低海马中与炎症相关的基因表达[12]。结合本研究结果提示，捏脊法可能通过提升LXA4水平促进机体炎症消退，这可能是捏脊法健脾祛伏痰防治儿童哮喘的重要机制之一。

4 结论

本研究表明，脾虚加重哮喘的肺部炎症程度，并有减缓炎症消退的趋势。捏脊法有助于改善脾虚症状，减轻脾虚哮喘的肺部炎症，并促进炎症的消退，这与其提升LXA4水平有一定的关系，可能是捏脊法防治儿童哮喘的重要机制之一。