苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠的改善作用及其机制❋

邹亚兴，吴文宇，罗 莉△，龙奉玺，郭 斌，陈 杰，王 倩，陈志平

(1.贵州省沿河土家族自治县看守所医务室，贵州 沿河 565300；2.贵阳中医学院第一附属医院，贵阳 550001；3.贵航贵阳医院，贵阳 550009；4.贵阳中医学院，贵阳 550002)

恶性肿瘤和心血管疾病(CVD)已成为中国人的主要死亡原因之一[1]，70%以上的老年肿瘤患者合并有心血管基础疾病[2]。因为抗肿瘤化疗药物普遍具有心血管毒性，降低了合并有心血管疾病患者对化疗的耐受性，提高了化疗风险。多柔比星是临床常用的蒽环类抗肿瘤药物，由于其可能导致充血性心力衰竭的副作用，极大地限制了其临床使用[3]。虽然严格控制多柔比星的使用量(低于550 mg/m2)可以显著降低其导致心力衰竭的风险，但对于合并心血管疾病的患者来说，其药物性心力衰竭的风险仍然很大。因此，在多柔比星治疗期间，保护心肌功能、降低心脏毒性、控制心力衰竭是必不可少的。笔者临床运用经方苓桂术甘汤配伍黄芪、丹参治疗化疗药物所致心力衰竭收到良好疗效。因此，本研究致力于探讨苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠30只，体质量(182±11.6) g，购于湖北省实验动物研究中心(许可证号SCXK(鄂)2015-0018)，饲养于贵阳中医学院基础实验室。实验环境25～30℃，相对湿度40%～45%，笼养，标准鼠食，自由饮水，适应性喂养7 d后开始造模。

1.1.2 试剂与仪器 苓桂术甘汤组成：茯苓12 g，桂枝9 g，白术6 g，甘草6 g，黄芪15 g，丹参10 g。中药饮片均购于贵阳中医学院第一附属医院门诊中药房，水煮醇沉浓缩法制成浓度为2 g/mL的浓缩液冷藏备用。注射用盐酸多柔比星(DOX)，海正辉瑞(批号15008511)；大鼠三磷酸腺苷(ATP)、大鼠一磷酸腺苷(AMP)、大鼠游离脂肪酸(FFA)酶联免疫分析ELISA测试盒，R&D，美国；AMPKα、p-AMPKα(Thr172)抗体，CST，美国；超声诊断系统，加拿大Vevo 770；MP-150型多道生理记录仪，普升科技有限公司；SZ-40体视显微镜，Olympus，日本；RM2255全自动切片机，LEICA，德国；电泳仪，北京六一仪器厂；蛋白质电泳及转膜系统，Bio-Rad，美国；倒置显微镜，Olympus，日本；酶标仪，Bio-Rad，美国。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 多柔比星所致心力衰竭模型参考文献制备[4],腹腔注射多柔比星2.5 mg/kg，每周3次，连续2周共6次，总剂量15 mg/kg。经超声心动图检测左室射血分数较基线减少10%者为造模成功。

1.2.2 分组及处理 30只大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和苓桂术甘汤治疗组3组各10只。对照组腹腔注射0.9%生理盐水2.5 mg/kg，每周3次，连续2周共6次，其余组按心力衰竭模型制备。治疗组给予苓桂术甘汤(0.2 g/ml)灌胃治疗，每日1次共2周。对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次共2周。

1.2.3 检测指标

(1)超声心动图检测：所有动物在实验开始前及2周、4周各做1次超声心动图评价心脏功能。实验大鼠胸前剃毛，经1.5%～2.0%异氟烷麻醉并固定四肢。采用加拿大Vevo 770 (Visual Sonics Inc, Toronto, ON, Canada)17.5 MHz高频率探头(model 716)进行超声检查[5]。测定左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张期后壁厚度(LVPWd)、左室收缩期后壁厚度(LVPWs)、左室射血分数 (%EF)和左室短轴缩短率(%FS)。

(2)血流动力学检测：常规麻醉、固定，经右侧颈总动脉行左心室插管，多道生理记录仪记录左室收缩压(left ventricle systolic pressure，LVSP)、左室舒张末期压力(left ventricle end-disatolic pressure，LVEDP)、左室内压最大上升速和下降速率(±dp/dtmax)。

(3)全心质量指数(HW/BW)测定：实验大鼠在检测前用电子天平称体质量(BW)。实验完毕后开胸取出心脏，用生理盐水将血洗净，用吸纸吸去水分，用天平称取全心质量(HW)，并计算出全心质量指数(HW/BW)。

(4)病理切片制作与染色：心脏组织4%多聚甲醛固定24 h后，依次浓度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片与烤片，常规苏木精HE染色，电子显微摄像机拍照。

(5)ELISA法检测心肌组织中ATP、AMP、FFA蛋白水平：分别取各组心肌组织100 mg在冰上剪碎，超声裂解，4 ℃ 13500 rpm离心30 min，取上清按ELISA试剂盒测定ATP、AMP、FFA蛋白含量。

(6)Western blot法检测心肌组织中AMPK-α、p-AMPK-α蛋白含量：取液氮冻存的心肌组织，用RIPA裂解液提取蛋白后，BCA法蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，湿法将电泳所得胶上的蛋白电转到PVDF膜上，用37 ℃封闭2 h勿洗，加一抗(AMPK-α为1∶1000，p-AMPK-α为1∶200)4 ℃下孵育过夜；TBST溶液洗涤3次，每次10 min；加山羊抗兔二抗(AMPK-α为1∶5000，AMPK-α为1∶2000)，室温下摇床摇摆1 h；TBST溶液洗涤3次，每次10 min；ECL化学发光试剂显色曝光，用Quantity One分析AMPK-α、p-AMPK-α和内参β-actin的灰度值[6]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠心功能的影响

表1显示，模型组大鼠与对照组比较，%EF和%FS 明显下降，心衰明显，LVIDs显著增大，LVPWd和LVPWs显著变薄，差异有统计学意义(P<0.05)。另一方面，苓桂术甘汤治疗组和模型组比较，可显著改善LVIDs增大、LVPWd及LVPWs变薄的情况，同时%EF和%FS显著回升，心脏功能得到恢复，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠心功能影响比较(例，

注：与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.2 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠血流动力学的影响

表2显示，模型组大鼠与对照组比较，LVSP和+dp/dtmax明显下降，而LVEDP和-dp/dtmax明显升高(P<0.05)，LVEDP值无明显变化，表明模型大鼠左心室泵血能力下降。治疗组对各指标均有不同程度的改善作用，且差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠血流动力学的影响(例，

注：与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.3 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠HW/BW比值及心肌能量代谢的影响

表3显示，模型组大鼠与对照组比较，BW明显下降，HW/BW比值明显增加，ATP含量显著降低，AMP、FFA含量及AMP/ATP比值明显升高(P<0.05)。与模型组比较，苓桂术甘汤治疗组BW回升，HW/BW比值降低，且治疗组大鼠心肌组织ATP含量明显上升，AMP、FFA含量及AMP/ATP比值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠HW/BW比值及心肌能量代谢的影响(例，

注：与对照组比较:*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05

2.4 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠对心肌组织的影响

图1显示，模型组与对照组比较，心脏左室内径明显增大，左室后壁变薄，纤维稀疏。苓桂术甘汤治疗组心脏左室内径及左室后壁较模型组有改善效果。从图2可以看出，对照组心肌细胞正常，无空泡变性、坏死、水肿，细胞质丰富均匀，细胞间隙正常，肌纤维无肥大、排列整齐，无肌纤维断裂。模型组可见心肌细胞肥大，心肌细胞的胞浆内有空泡形成、间质水肿、心肌细胞间隙增宽、心肌纤维断裂和肌原纤维溶解。苓桂术甘汤治疗组少见心肌细胞肥大、空泡及水肿，心肌细胞间隙略宽，少见心肌纤维断裂。

图1 大鼠心脏大体病理切片 HE 染色结果(HE ×1.2)

图2 大鼠心肌病理切片 HE 染色结果(HE × 200)

图3 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠p-AMPKα/AMPKα的影响注：与对照组比较:*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05

2.5 苓桂术甘汤对多柔比星所致心力衰竭大鼠p-AMPKα/AMPKα的影响

图3显示，模型组大鼠与对照组比较，大鼠心肌组织p-AMPKα蛋白表达明显升高，p-AMPKα/AMPKα比值明显增强(P<0.05)；苓桂术甘汤治疗组p-AMPKα蛋白表达明显减弱，p-AMPKα/AMPKα比值明显降低(P<0.05)。

3 讨论

根据结果显示，腹腔注射多柔比星2周后，大鼠存在明显的心力衰竭。其LVIDS增大，LVPWD和LVPWS变薄，EF和FS明显下降，HW/BW升高。而给予苓桂术甘汤治疗2周后，其各项指标明显改善，提示苓桂术甘汤能改善心脏功能，具有抗多柔比星心肌毒性的作用。同时发现，苓桂术甘汤可能通过抑制AMPK活化，降低心肌游离脂肪酸，抑制脂肪酸氧化，增加ATP，改善心肌能量代谢，从而达到控制心力衰竭的作用。

苓桂术甘汤出自《金匮要略》“病痰饮者，当以温药和之。[7]”本方重用茯苓为君，取其甘淡可健脾利水、渗湿化饮，以桂枝为臣，温阳化气，平冲降逆。加用黄芪、丹参为臣，补其补气活血之功。白术健脾燥湿为佐，炙甘草为使药，一可助桂枝温补中阳之力，二可合白术益气健脾，三可调和诸药。有研究证实，苓桂术甘汤能改善心力衰竭大鼠心功能和左室重构[8]。其他研究也证实，黄芪在临床被广泛应用于治疗慢性心力衰竭[9]，丹参能降低阿霉素所致的心脏毒性[10]，可减少心肌细胞凋亡，保护心脏功能，降低心力衰竭风险[11]。本研究发现，腹腔注射多柔比星后，模型组左室内径增大，左室壁及右室壁均变薄，提示腹腔注射多柔比星后可导致全心的衰竭，这与文献描述相似[12]。心力衰竭后单位质量的心肌毛细血管及线粒体数目减少，使氧的弥散间距增大和氧利用能力降低，故心肌缺血缺氧，加剧心肌能量代谢障碍[13]。由此进一步证实，苓桂术甘汤对多柔比星所致的心力衰竭具有保护作用。

能量代谢是心力衰竭重要的病理生理环节，其改变在心力衰竭的发病机制中起重要作用，因此调节心脏的能量代谢有可能成为心力衰竭治疗中的一种新方法[14]。心力衰竭时出现的心肌能量代谢异常通常与心功能异常相伴，并在底物利用、氧供、ATP产生、转运、利用等多环节产生代偿性变化，最后出现能量失代偿。AMPK可以从代谢底物调控、线粒体功能等方面发挥作用，相互协调调控心肌能量代谢。AMPK可增加FFA的氧化而改善心力衰竭心肌FFA的积累[15]。心肌线粒体脂肪酸β-氧化 (FAO)产生的能量是心肌能量代谢的主要来源[16]。本研究发现，模型组FFA升高，而ATP下调，这与心力衰竭的心肌能量代谢障碍相一致[17]；苓桂术甘汤能降低FFA水平，提高ATP含量，提示苓桂术甘汤可能通过降低FFA水平，抑制脂肪酸氧化，增加ATP合成，改善心肌能量代谢，从而达到控制心力衰竭的作用。在心力衰竭缺血缺氧状态下，AMP/ATP比值显著增高使AMPK激活，其作用点是磷酸化AMPKα亚基172位苏氨酸[15]。本研究模型组符合前述。有研究表明，AMPK的活化增强脂肪酸氧化，导致葡萄糖氧化降低，增加糖酵解有害副产品(乳酸和质子)的堆积，使ATP主要用于清除这些副产品的堆积，而不是被利用于肌肉收缩，从而使心脏功能和效率降低[18]。苓桂术甘汤能降低AMP/ATP比值，抑制AMPK活化，增加ATP的合成，改善心肌能量代谢，从而达到控制心力衰竭的作用。