薄层扫描法同时测定三七细粉中皂苷含量△

何福龙，郑艳萍，任娟，金俊杰2，，白发平，蔡宝昌2，

(1.广西贺州职业学院，桂东卫生学校，广西 贺州 542899；2.南京海昌中药集团有限公司，江苏 南京 210061；3.南京海源中药饮片有限公司，江苏 南京 210061)

三七为五加科人参属植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的块根[1]。三七现代药理作用主要体现在对心血管和脑血管等血液系统、神经系统、代谢和免疫调节系统等的影响[2-3]。三七自古以活血散瘀功效著名，能抗血小板聚集，抗血栓形成[4]。其主要有效成分为皂苷类化合物[1]，迄今已从三七中分离得到70余种三萜皂苷，其中以三七皂苷R1，人参皂苷Rb1、Rg1和Rd 等皂苷类成分含量较高。三七皂苷类成份的定量分析可采用 TLC、HPLC、GC和比色法等方法。比色法基于三萜骨架结构或糖基和羧基的化学反应，专属性差且只能测定总皂苷的含量[5]；气相色谱虽然具有较高的灵敏度和分辨率，但样品需要复杂的前处理以降低其沸点[6]；高效液相色谱法是目前广泛使用的方法，利用梯度洗脱，可使大部分皂苷较好的分离，但是由于三萜皂苷分子中不具备较好的发色团[7]，UV检测常用波长为203 nm，许多化合物及溶剂都对检测有干扰。TLCS可以同时进行多通道的展开、扫描，节约使用溶剂和时间，是皂苷类成分分析的常用方法之一。

本研究通过薄层扫描法同时测定三七细粉中人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量，建立同时测定三种皂苷的含量的薄层扫描的方法。本实验采用薄层色谱扫描法，通过对供试品溶液的制备、展开条件的改进，使人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的色谱斑点分离良好，扫描色谱峰稳定、可测，并在不同批次的三七粉中得到了验证，取得了较好的分离效果，可以同时测定多个样品中三个皂苷的含量，大大提高了该品种的检测效率。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CAMAG公司薄层色谱系统，包括半自动点样仪linomat5-1507及自动成象系统Visnaliter-151204；FA1104型电子分析天平，精度0.01 mg(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

三七细粉：南京海源中药饮片有限公司，批号：151023、160307、160601，规格：66 g/瓶，亳州中药材市场购买两批(S1、S2)，云南文山购买一批(Y1)；人参皂苷Rg1对照品(批号：110703-201530)、三七皂苷R1对照品(批号：110745-201619)、人参皂苷Rb1对照品(批号：110704-201424)，均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G(青岛海洋化工厂分厂)；其余试剂均为分析纯；水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1对照品适量，分别精密称定，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.504、0.501 、0.492 mg·mL-1混合对照品溶液，备用。

2.2 供试品溶液的制备

取本品三七细粉0.2 g，置索式提取器中，加乙醚80 mL，加热回流提取1 h，弃去乙醚液，药渣挥去溶剂，加甲醇80 mL， 加热回流至无色，提取液挥干，残渣加甲醇适量，并转移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，备用[8-9]。

2.3 预处理、层析及测定

照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2015年版通则0502)试验，精密吸取混合对照品溶液2、8 μL，供试品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置12 h的下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，晾干，至366 nm下检视后(见图1)，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶带固定，照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2015年版通则0502)进行扫描(见图2)，检测波长510 nm，参比波长700 nm，测得供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，根据外标两点法计算，即得。

注：1.混合对照品2 μL(从下到上分别是人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1)；2.混合对照品 8 μL(从下到上分别是人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1)；3～4.供试品Y1；5～6.供试品S1；7～8.供试品S2；9～10.供试品151023；11～12.供试品160307；13～14.供试品160601。图1 三七薄层色谱图(366 nm)

注：1.混合对照品2 μL(从左到右分别是人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1)；2.混合对照品 8 μL(从左到右分别是人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1)；3～4.供试品Y1；5～6.供试品S1；7～8.供试品S2；9～10.供试品151023；11～12.供试品160307；13～14.供试品160601。图2 三七薄层扫描3D色谱图(检测波长510 nm，参比波长700 nm)

2.4 线性关系的考察

精密吸取上述混合对照品溶液各1、2、4、6、8、10 μL，分别点于薄层板上，按上述2.3项方法测定(见图3，图4)吸光度积分值，以人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1进样量为自变量 (X)，峰面积积分值为因变量 (Y)，进行线性回归，得回归方程Y人参皂苷Rb1=1 120.1X+271.29，r=0.998 5；Y三七皂苷R1=2 105.2X+135.20，r=0.999 1；Y人参皂苷Rg1=1 085.1X+71.034，r=0.998 2。实验表明，人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1在0.504～5.04 、0.501～0.504、0.492～4.92 μg范围内具良好的线性关系。

注：从下到上分别是人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1对照品。图3 混合对照品薄层色谱图(366 nm)

注：1～6分别为混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL点样的薄层扫描图(从左到右分别是人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1扫描峰)。图4 混合对照品薄层扫描3D色谱图(检测波长510 nm，参比波长700 nm)

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液2 μL，分别点于2块薄层板上，各点6份，按2.3项下方法进行测定，结果人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的 RSD 分别为1.87%、1.02%、1.56%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液(批号：160601)2 μL按上述方法于0、10、20、40、60 min测定，结果，人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1峰面积RSD分别为 1.64%、1.96%、 1.72%。结果表明样品60 min内测定稳定。但文献[9]认为显色后30 min测定较好。

2.7 重复性试验

取三七粉(批号：160601)样品5份，按2.2、2.3的方法进行提取、展开、显色、测定。测得该批号三七细粉中人参皂Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1质量分数平均值为31.25、50.72 、59.86 mg·g-1，RSD分别为1.53%、1.05%、1.86%，结果表明此方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

精密称定三七粉(批号：160601，含人参皂苷Rb131.25 mg·g-1、三七皂苷R150.72 mg·g-1、人参皂苷Rg159.86 mg·g-1)样品0.1 g，精密加入人参皂苷Rb1对照品约3 mg、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1对照品约6 mg，按2.2项下方法制备供试品溶液，平行6份，按上述方法测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收实验结果(n=6)

2.9 样品测定

取三七粉6批，按照2.2项下方法制备供试品溶液，同法测定，结果见表2。

3 讨论与小结

《中华人民共和国药典》2015年版一部三七项下鉴别方法处理三七样品，展开后薄层斑点较多，分离度不好，薄层扫描色谱峰相互交叉，定量不精确。本实验测定方法在此基础上进行了修改，采取先用乙醚提取，除去部分极性较低的成份后，加甲醇回流提取人参皂苷类成分进行薄层色谱分析，薄层色谱斑点少，分离度良好，定量精准[10]。

样品预提取、展开晾干后，喷10%硫酸乙醇溶液110 ℃烘至显色清晰后，应立即用等大的透明玻璃板覆盖，周围并用透明胶封严，以免斑点氧化褪色。人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的定量测定方法也有采用 HPLC 法[11]，但因其为末端吸收低，测定时间长、成本高、速度慢等问题不适合三七检测，而TLCS法解决了过这些问题，可以在同一块薄层板上同时测定多个样品，且速度快，同时避免了末端吸收差的问题。因此本研究所建立的方法更易于广泛推广和三七的快速检测。