Wnt/β-catenin通路在脉冲强磁场促神经干细胞增殖中的作用初探

龙兴蓝，许涛，邹丽丽 ，蒋婷，彭涛，孙衢骎

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是一种可以自我增殖、迁移并且能向神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞定向分化的干细胞[1-2]。NSCs的这种自我增殖及定向分化的特性，使其在神经系统疾病中的应用逐渐增多，特别是在退行性神经系统疾病中，如帕金森病等[3-4]。在疾病的治疗中NSCs的作用主要有两种，一种是替代治疗[5]，另一种是基因治疗[6]。上述两种方法都需要将大量的NSCs移植到神经系统的相应部位以发挥作用。然而NSCs为终末分化前体细胞[7]，其来源少，生长缓慢，增殖能力较弱，获取、培养与基因修饰都很困难，使大量获取NSCs成为困难，不能满足各种研究对其的需要。在前期实验中我们发现脉冲强磁场作为一种物理方法可以促进NSCs增殖[8-9]，在场强4T，频率0.1Hz，刺激次数8次时，此种作用最明显。wnt/β-catenin通路是NSCs增殖与分化过程中的关键环节，在4T、0.1Hz、8次条件下的脉冲强磁场刺激过程中，可以观察到β-catenin的表达增加。虽然脉冲强磁场可以促进NSCs增殖，但是其机制还不明晰，因此我们需要进一步明确wnt/β-catenin通路在脉冲强磁场促NSCs增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 ①实验动物: 出生72h以内新生的SD大鼠，不限雌雄，购买于华中科技大学同济医学院实验动物中心。②实验试剂：DMEM/F12高糖培养基(Hyclone公司)，B27(美国nitrogen公司)，大鼠碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor, bFGF) (美国Gibco公司)，人表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)(美国Gibco公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，逆转录试剂盒和qPcr试剂盒(美国Fermentas公司)。

1.2 方法 ①NSCs的取材和培养：采用断颈法处死出生72h以内的SD大鼠乳鼠，然后浸泡于75%的酒精消毒。剪开乳鼠头皮，打开颅骨，暴露脑组织，随后去除表面的血管和筋膜。然后取出侧脑室部位组织，并再次去除血管和筋膜。将脑组织块剪碎成1mm3大小，并制成单细胞悬液，随后过滤并离心。随后用含2% B27、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF的新鲜培养基重悬沉淀，并接种在50ml培养瓶中。在37℃、5% CO2的培养箱中培养，每3天半量换液，每7天传代。②NSCs免疫组化：使用4%的多聚甲醛固定细胞并自然晾干。滴加3%过氧化氢后在室温下孵育15min，用PBS冲洗3次，然后滴加Nestin抗体4℃孵育过夜。PBS 冲洗3次，滴加聚合物辅助剂， 37℃孵育20min。再用PBS冲洗，然后加辣根过氧化物酶标记二抗IgG多聚体， 37℃孵育20～30min。然后PBS冲洗4次，加DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色。最后使用Harris苏木素复染，脱水及封片后在显微镜下拍照。3．RNAi抑制NSCs中β-catenin的表达。③构建β-catenin shRNA 慢病毒载体: 根据Genbank中β-catenin RNA(NM_053357.2，GI：46048608)序列及查阅文献后，选取长度为19nt的干扰序列：β-catenin：5'-AAGATCTGAAGGCAGTCTG-3'；分别靶向β-catenin基因的第898～917位碱基。其对应的shRNA序列的DNA序列如下(5'-3')：shRNA:GATCCCAAGATCTGAAGGCAGTCTGTCTTCAAGAGAGACAGACTGCCTTCAGATCTTTTTTTGGAT。并将其制作成能表达绿色荧光的慢病毒载体(由上海吉凯基因公司完成)。慢病毒转染NSCs，并观察不同感染复数(multiplicity of infection，MOI)值时RNAi慢病毒对神经干细胞中β-catenin mRNA的水平的影响: 将第一次传代后并培养4d的104个目的细胞接种于6孔板中；加入助染剂polybrenen，使其终浓度为5μg/ml；以MOI=0、0.1、1、10的浓度，加入慢病毒，并于24h后更换新鲜培养基。在转染后3d在基因水平检测各组细胞β-catenin的表达。用Real Time PCR检测β-catenin和内参基因的cDNA的扩增产物CT值进行相对定量分析。用BioRad IQ5软件制作实时PCR扩增曲线、熔解曲线及数值分析，用GraphPad PRISM 5.0软件制图。并计算不同MOI时，β-catenin的抑制效果。RNAi慢病毒对神经干细胞中β-catenin mRNA的水平的影响：将前面经慢病毒转染后的NSCs，在转染后3d在基因水平检测各组细胞β-catenin的表达。用Real Time PCR检测β-catenin和内参基因的cDNA的扩增产物CT值进行相对定量分析。用BioRad IQ5软件制作实时PCR扩增曲线、熔解曲线及数值分析，用GraphPad PRISM 5.0软件制图。并计算不同MOI时，β-catenin的抑制效果。Real Time PCR过程：使用Trizol法提取脉冲强磁场干预后7d的NSCs的总RNA，并检测器浓度及纯度；根据所测总RNA的浓度，每组分别加入Oligo(dt)及DEPC水并于65℃温度下变性5min。然后加入5×Reaction Buffer、RNA酶抑制剂、dNTP混合物及M-MLV逆转录酶。随后42℃孵育60min，70℃加热5min终止反应；取模版cDNA，分别加入上下游引物、SYBR荧光染料和超纯水，经历预变性、变性、退火/延伸过程；用BioRad IQ5软件制作实时PCR扩增曲线、熔解曲线及数值分析，用GraphPad PRISM 5.0软件制图。RNAi慢病毒对NSCs中β-catenin 蛋白水平的影响: 将前面经慢病毒转染后的NSCs，在转染后3d用Western blot法检测各组细胞β-catenin的表达。各组β-catenin的相对含量用β-catenin与内参的吸光度比值来表示。Western blot过程：电泳,用RIPA裂解液，测蛋白浓度后取50ug总蛋白上样电泳；转膜(湿转法)，取出凝胶根据Marker切下目的条带，蒸馏水冲洗后，将甲醇浸泡的PVDF膜和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中，然后使用nestin---200mA，60min后，300mA，60min进行转膜；封闭，封闭液浸泡PVDF膜并封闭2h；随后加一抗及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的二抗；显色曝光，将充分洗涤的PVDF膜滴加ECL底物液，孵育后显影、定影。④脉冲强磁场干预及CCK8检测干预后的NSCs增殖情况：将NSCs分为阴性组(转染无抑制β-catenin表达作用的对照病毒)和实验组(β-catenin shRNA病毒转染组)；在转染后4d将NSCs移转移进15ml离心管中，使用条件为4T、0.1Hz、8次的脉冲强磁场干预[10-11]；干预完后更换新鲜无血清培养基，随后放入培养箱中培养。④将经过干预后的1d、7d的各组细胞制成单细胞悬液并接种于96孔板中，使每孔细胞悬液的总体积为200μl，并培养数小时；加入CCK8试剂20μl后孵育4h，在酶标仪490nm波长下读取各孔OD值。每组设置6个复孔，实验重复3次，最后计算平均值。

1.3 统计学方法 采用GraphPad PRISM 5.0统计软件分析。其中CCK8检测的计量资料均数采用可重复的双因素方差进行统计学分析，其余结果采用单因素方差进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCs形态观察及免疫组化染色 取材后在倒置显微镜下可观察到悬浮于培养基中的絮状组织块。取材3d后，在悬浮的组织块周围可观察到聚集生长的NSCs，NSCs胞体呈圆形，透亮，折光性好。取材7d后，可见悬浮生长的NSCs并聚集成球，传代时可见部分神经球融合。见图1，2。采用课题组前期NSCs鉴定方法。取材后一周在光镜下可见大量神经球(图1)，对其进行免疫组化染色，可见其中含有大量棕褐色颗粒，说明nestin的阳性表达(图2)，染色的部位主要在细胞质内，细胞染色均匀，大小一致，苏木素复染后可看到深染的细胞核[9-14]。

图1培养基中悬浮生长的神经球(×100)图2nestin表达阳性的神经球(×40)

2.2 慢病毒转染NSCs并观察不同MOI值时RNAi慢病毒对NSCs中β-catenin mRNA的水平的影响

2.2.1 Real Time PCR检测结果 转染后3d，在MOI=0、MOI=0.1、MOI=1及MOI=10时，在基因水平使用Real Time PCR检测NSCs mRNA的表达情况，和MOI=0时比较，在MOI=0.1、MOI=1及MOI=10时，均存在显著性差异(均P<0.01)。说明在MOI=0.1、MOI=1及MOI=10时，β-catenin的mRNA表达均减少，在MOI=10时最明显。见图3。

图3不同MOI时β-catenin mRNA 表达水平，a为MOI=0，b为MOI=0.1，c为MOI=1，d为MOI=10

2.2.2 Western Blot检测结果 β-catenin蛋白的表达水平，各组细胞GAPDH条带宽度相似，β-catenin条带组则在MOI=1、10时，条带宽度明显变细，如图4从左至右，在MOI=0、MOI=0.1、MOI=1及MOI=10时，β-catenin蛋白表达均减少。β-catenin与内参比值比较，可见从a到d，β-catenin/GAPDH呈下降趋势，见图5。

β-catenin GAPDH

图4转染72h后，β-catenin蛋白的表达，a为MOI=0，b为MOI=0.1，c为MOI=1，d为MOI=10。各组细胞GAPDH条带宽度相似，β-catenin条带组则在MOI=1、10时，条带宽度明显变细

图5转染72h后，β-catenin与内参GAPDH的比值，a为MOI=0，b为MOI=0.1，c为MOI=1，d为MOI=10

2.3 CCK8检测脉冲强磁场干预后的NSCs增殖情况 我们用β-catenin shRNA 序列慢病毒和阴性慢病毒(只含有GFP，但无抑制β-catenin效果)转染NSCs，然后用4T、8次、0.1Hz的脉冲强磁场干预NSCs后，用CCK8试剂测试干预后1d、7d 时NSCs的增殖情况，与未经干预的对比。我们发现阴性组在干预后1d、7d增殖明显(P<0.05)，而实验组在干预前后NSCs增殖水平无明显变化。见图6,7。

与未干预组比较，*P<0.05

图6干预后1d用CCK8法检测NSCs增殖水平

与未干预组比较，*P<0.05

图7干预后7d用CCK8法检测NSCs增殖水平

3 讨论

在湖北省青年科技人才基金以及国家自然科学基金的资助下，课题组前期成员利用国内首个脉冲强磁场对NSCs的作用进行了探索。利用华中科技大学的脉冲强磁场装置，发现其对NSCs有促增殖作用，且这种作用在4T、 0.1Hz、8次的刺激条件下最明显。随后我们发现在4T、 0.1Hz、8次的刺激条件下，NSCs中的β-catenin的表达增加[12]。而wnt/β-catenin通路又与NSCs的增殖有关，因此考虑前期课题组成员发现的脉冲强磁场促进NSCs增殖的效应可能是通过wnt/β-catenin经典通路起作用。在本实验中我们采用RNAi方法抑制NSCs中该通路的表达。在获得抑制β-catenin表达的NSCs后，用4T、 0.1Hz、8次的脉冲强磁场干预NSCs。在干预后1d、7d分别用CCK8法检测实验组与阴性组NSCs增殖水平，发现在干预前后，阴性组NSCs增殖明显，而实验组NSCs增殖则无明显变化。从图6、7可以看到，1d时阴性组和实验组在干预前后细胞数量变化水平小于7d时阴性组和实验组在干预前后细胞数量变化。在1d、7d时干预后，阴性组细胞增殖明显，而实验组细胞增殖变化不明显，说明在抑制β-catenin表达后，实验组的细胞增殖减少，而未抑制β-catenin时，阴性组的细胞增殖明显。

Wnt/β-catenin 信号通路在NSCs的增殖与分化过程中具有的关键作用，其在胚胎发育和肿瘤形成中起到非常关键的调控作用[13]。现已知wnt/β-catenin 信号通路几乎在神经发生的所有方面起作用，特别是经典wnt通路。其主要涉及以下4个方面：①神经管的发生；②维持神经前体细胞状态并控制其分化；③NSCs增殖；④参与轴突和树突的发生，突触的形成和突触的可塑性[14-16]。

不同阶段的神经发育均需Wnt基因的表达，特别是在胚胎神经系统发育过程中，经典Wnt信号通路参与胚胎NSCs的增殖与分化[17]。现有研究表明，Wnt/β-catenin 信号通路能够明显调控NSCs的增殖与分化。Wnt/β-catenin 通路激活可使成人海马区域皮质出现NSCs增殖。而稳定低水平表达的β-catenin蛋白则可使转基因小鼠大脑皮质NSCs增殖，并使皮质表面积增大[18]。Wnt通路与Notch 通路在出生后的神经形成过程中，协同作用增强了NSCs的分化，Wnt-1 可通过缩短细胞分裂周期促进NSCs的增殖[10]。此外，很多促NSCs增殖的方法也都是通过Wnt/β-catenin 通路发挥作用[17]。

前面提到，wnt/β-catenin通路参与了NSCs的增殖与分化过程，其能调节NSCs的数量，使其保持干细胞特性[18-19]。因此推测wnt/β-catenin通路在脉冲强磁场促进NSCs增殖的作用中可能通过这几个方面起作用：①脉冲强磁场可以促进细胞外wnt1、wnt3蛋白表达，从而促进wnt蛋白与细胞膜上受体结合并启动wnt/β-catenin通路。②经典wnt/β-catenin通路中，wnt蛋白与细胞膜上受体结合后，使NSCs细胞内LRP6发生磷酸化，从而增加NSCs内β-catenin数量因此我们认为脉冲强磁场干预NSCs后，通过LRP6的磷酸化间接增加β-catenin数量而表现促增殖效应[20]。③脉冲强磁场干预NSCs后抑制GSK3β，从而增加β-catenin数量。有关wnt/β-catenin通路在神经系统的作用中的研究也提到wnt/β-catenin通路能控制NSCs的增殖与分化，稳定表达低水平β-catenin 蛋白可促使转基因小鼠大脑皮质NSCs增殖及皮质表面积增大[15]。此研究也发现脉冲强磁场促NSCs增殖现象与wnt/β-catenin通路有关，且这种现象在抑制NSCs中β-catenin表达后不明显，这与文献报道相符合。

综合考虑，经4T、 0.1Hz、8次的脉冲强磁场干预的NSCs，其β-catenin数量增加，并与细胞核中的转录因子TcF/LEF结合[21]，从而调节与增殖相关基因的转录，表现出促进NSCs增殖现象。因此认为脉冲强磁场促NSCs增殖现象与wnt/β-catenin通路有关。对wnt/β-catenin通路在脉冲强磁场促NSCs增殖效应中的作用的研究有利于弄清脉冲强磁场促NSCs增殖的机制，对后期经脉冲强磁场干预后的NSCs的安全性、分化研究都有帮助，并对将经过脉冲强磁场干预后的NSCs移植提供稳定、安全的细胞来源。由于NSCs增殖还与Notch通路、Shh-Gli通路、PPARγ通路等有关，但是本实验由于时间限制未检测上述通路在脉冲强磁场促NSCs增殖中的作用，后期可对相关通路在脉冲强磁场促NSCs增殖中的作用行进一步研究。