紫外分光光度法测定双黄连粉针剂中总黄酮的含量

冯文军 李文春 解黎雯 李殿明 付饶

摘 要：目的：建立以黄芩苷作为对照品，采用三氯化铝（AlCl3）比色法测定双黄连粉针剂总黄酮含量方法。方法：通过对双黄连相关提取物在AlCl3显色后的吸收峰（200～500nm）进行比较，分析以黄芩苷为对照品的AlCl3比色法测定双黄连粉针剂中总黄酮的合理性。结果：AlCl3显色后，双黄连粉针、黄芩提取物、黄芩苷在336nm处有较强吸收。结论：采用AlCl3比色法测定双黄连粉针剂总黄酮的含量具有合理性，本法简便、准确、快捷，可作为本药的质量控制方法。

关键词：双黄连粉针剂；总黄酮；三氯化铝比色法；黄芩苷

中图分类号：R286 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2018）14-0218-03

根據中药注射剂安全性再评价的相关要求，《中药注射剂安全性再评价质量可控性评价技术原则》（试行）明确指出：“多成份制成的注射剂结构明确成分的含量因品种而异；所测各类成分之和应尽可能大于总固体的80%。”“多成份制成的注射剂，含测指标的选择应为大类成份含测加单一成份含测，如：某注射剂中含黄酮、皂苷、生物碱等，需要分别建立总黄酮、总皂苷、总生物碱类的测定，还需分别对黄酮、皂苷、生物碱中的单一代表成份进行含量含测（HPLC或GC法等）。”因此建立双黄连粉针剂的总黄酮含量测定指标，以加强制剂质量控制。

1 仪器与试药

METTLER XS205型电子分析天平（梅特勒-托利多（瑞士）有限公司）；TU-1901型 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；芦丁对照品（供含量测定用，批号：100080-200306）；黄芩苷对照品（供含量测定用，批号：110715-200514，110715-200815），化学对照品由中国药品生物制品检定所提供；三氯化铝，分析纯（天津试剂厂）；氢氧化钾，分析纯（天津市凯通化学试剂有限公司）；冰醋酸，优级纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；醋酸钠，分析纯（哈尔滨市新春化学试剂厂）；甲醇，分析纯（北京化工厂）；其余试剂为市售分析纯；双黄连粉针剂（哈药集团中药二厂，规格：600mg/支，批号：0903237、0903238、0903239、1005206、1005207、1005208、1001230、1001231、1001232）；注射用双黄连（冻干）（哈药集团中药二厂，规格：600mg/支，批号：0902004、0902005、0902006）；注射用双黄连（冻干）（哈药集团中药二厂，规格：1.2g/支，批号：1002102、1002103、1002104）。

2 试验方法与结果

2.1 试验方法[1-3]

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取黄芩苷对照品10mg，置50mL量瓶中，加50%甲醇适量，使溶解，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取20mL至50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL 含黄芩苷0.08mg）。

2.1.2 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别置25mL量瓶中，各加水至5mL，加醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH=4.5）5mL，再加1.5%三氯化铝溶液5mL，摇匀，再加水至刻度，摇匀，放置50分钟，以0mL为空白，照分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在336nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，对照品重量为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.3 供试品溶液的制备

取本品40mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1mL置25mL量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“置25mL量瓶中，加水至5mL……”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中黄芩苷的重量，计算，即得。

2.2 最大吸收波长的确定

吸取对照品溶液4mL、供试品溶液1mL分别置25mL量瓶中，准确加入pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液5mL和1.5%三氯化铝5mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置50min，以水5mL如上法操作得空白溶液，于紫外可见分光光度计上，在200～500nm波长范围内进行扫描。结果对照品溶液和供试品溶液在336nm波长处均有最大吸收，故确定测定波长为336nm。同时黄芩提取物也在相同波长处有最大吸收。详见图1-4。

2.3 线性关系的考察

研究方法：2.1项下的2.1.1及2.1.2方法，在336nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，对照品重量为横坐标，绘制标准曲线。计算回归方程为：Y=0.57378X+0.01282，相关系数为：r=0.9999。表明黄芩苷在0.0864mg～0.432mg范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

取双黄连粉针剂1001232，精密称定，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液。依法进行测定6次。记录吸收值，结果平均值为0.4575，RSD=0.12%。由此可见，该方法精密度较好。

2.5 供试品溶液稳定性试验

取双黄连粉针剂1001232，精密称定，照2.1.3方法制备供试品溶液。分别在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时吸取1mL依法测定。记录吸收值，结果平均值为0.4887，RSD=0.54%。由此可见，该方法双黄连粉针剂的水溶液，在室温条件下密闭放置24小时，稳定性良好。

2.6 显色稳定性试验

取双黄连粉针剂1001232，精密称定，照2.1.3方法制备供试品溶液。依法测定，之后每隔25min测定一次。记录吸收值，结果平均值为0.5161，RSD=0.52%。由此可见，该方法150分钟内显色稳定性较好。但随时间延长吸收度有降低趋势，因此建议50-100分钟内测定完成。

2.7 重复性试验

取双黄连粉针剂1001232，精密称定6份，每份与约40mg，照2.1.3方法制备6份供试品溶液。依法测定。计算含量，结果平均值为34.855%，RSD=0.1.86%。由此可见，该方法重复性较好。

2.8 回收率试验

取双黄连粉针剂1001232，精密称定6份，每份与约20mg，同时各精密吸取黄芩苷对照品溶液（相当黄芩苷7.23mg），分别加入上述6个量瓶中，照供试品溶液制备方法制备6个供试品溶液。依法进行测定。测定结果见表1。

由此可见，该方法加样回收率较好。

2.9 样品测定

取15批双黄连粉针剂其中喷干9批、冻干6批，分别依照质量标准中量测定项下规定的方法进行测定。结果见表2，表中数据为3次测定均值。通过15批双黄连粉针剂的含量测定，15批粉针的总黄酮平均含量为33.69%。

3 讨论

（1）通过预实验，黄酮含量测定方法中根据原理不同有4种方法，分别是三氯化铝法，酸性三氯化铝法，氢氧化钾法（碱溶液法），亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合比色法。根据显色原理第四種方法不能使黄芩苷（由于不含邻酚羟基）显色或显色不明显，同时显色受邻酚类化合物如绿原酸、连翘酯苷A等的干扰，与郭亚健等[4]报道一致。研究者曾用芦丁为指标测定双黄连中总黄酮约为27%左右，仅与黄芩苷含量相当，且黄芩苷对照品对吸收贡献值相对较小，不可取；前三种方法用黄芩苷为指标测定双黄连粉针剂（1001232）中总黄酮含量基本相当分别为35.2%、34.28%、32.6%，根据显色机理，酸性三氯化铝最适合双黄连粉针剂成分的测定，故选用酸性三氯化铝法测定双黄连粉针剂中的总黄酮，有人使用芦丁为对照[5]，芦丁最大吸收波长为410nm与黄芩苷、黄芩提取物、成品均不一致，因此对照品选用黄芩苷，由于金银花、连翘提取物中均有黄酮类成分，在黄芩苷336nm处均有吸收，能较全面地反应二者所含黄酮量。

（2）采用铝离子与黄酮类成分产生络合反应并产生相应颜色或荧光，可用于定性和定量。显色原理如图5：

三氯化铝显色法测定的原理为：在中性及碱性条件下，邻酚羟基均与Al3+络合产生的络合物，影响含量测定的准确性，只有在酸性环境下，黄酮醇母核中5位-OH、4位C=O与Al3+络合产生的络合物，且这个反应具有专属性。双黄连中黄酮类成分[6]：金丝桃苷、黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素、白杨素（Chrysin）等，其结构中均有5位-OH、4位C=O，并不含有B环的邻酚羟基，故该法适合用于双黄连总黄酮的含量测定。

参考文献

[1]马陶陶，张群林，李俊，等.三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨[J].时珍国医国药，2008，19（1）：54-56.

[2]裴咏萍，李维林，张涵庆，等.三氯化铝比色法测定中药中总黄酮含量的方法改进[J].现代中药研究与实践，2009，23（4）：58-60.

[3]周丽，周亚球，王效山，等.正交试验法优选红旱莲提取工艺[J].中国医院药学杂志，2010，30（14）：1246-1248.

[4]郭亚健，范莉，王晓强，等.关于NaNO2-Al（NO）3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨[J].药物分析杂志，2002，22（2）：97-99.

[5]刘金贤，王磊，管仁伟，等.比色法测定黄芩总黄酮的显色条件研究[J].中医药学报，2012，40（6）：34-36.

[6]李文春，孙永慧，解黎雯，等. HPLC同时测定双黄连粉针剂中15种成分含量[J].中国新药杂志，2014，23（22）：2614-2618.