库尔勒香梨kfpSPL及其启动子克隆分析

王玉凯，赵 欢，牛建新

(石河子大学农学院园艺系/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】库尔勒香梨是蔷薇科植物、梨属中的新疆梨种(Pyrussinkiangensisyu)。受遗传特性的影响，库尔勒香梨的果实萼片存在两种情况，即脱落与宿存，萼片的宿存形成宿萼果，大量的宿萼果导致果实果形不规则，严重影响果实的口感、外观与品质，致使库尔勒香梨降低其商品价值和市场竞争力。从分子水平研究库尔勒香梨kfpSPL基因与萼片脱落和宿存之间的关系，对提高库尔勒香梨果实的品质及外观有重要意义。【前人研究进展】近年来，关于库尔勒香梨萼片的发育规律及其萼片脱落过程中相关内激素的变化规律已有相关报道[1,2]。前人研究表明，库尔勒香梨的脱萼和宿萼差异表达的众多片段中有两条与苹果中的转录因子有较高的同源性[3，4]。此外，孙晓霞等[5]运用RNA-Seq技术获得库尔勒香梨脱萼组和宿萼组代表样品的转录本数据，筛选出脱萼组和宿萼组样品的差异表达基因并且获得了相应基因的功能注释。在王博慧等[6]的研究中发现，通过克隆技术得到了kfpMYB及其启动子，并对已获得的上游序列进行了生物信息学分析。在植物开花调控过程中SPL转录因子具有重要意义，控制植物开花的光周期诱导途径和赤霉素诱导途径[7]。【本研究切入点】以往对于库尔勒香梨脱萼和宿萼的研究主要集中在生理研究层面，如植物生长调节剂[8]、形态[1]、修剪[9]、光照[10]、授粉[11]等生理因素对库尔勒香梨萼片脱落与宿存的研究。作为调控基因的重要组成部分，启动子控制基因的表达时间和程度，它是一段特定的DNA序列，可与RNA聚合酶识别、结合及起始转录。研究库尔勒香梨萼片脱落与宿存的分子机理。【拟解决的关键问题】克隆kfpSPL基因的全长基因组DNA序列及其启动子，了解该基因如何应答激素和环境条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

4月中旬在新疆库尔勒市沙依东园艺场五分场，标记3株树龄为10a的库尔勒香梨树作为试验树，于盛花期(全树50%花朵开放)，采集标记库尔勒香梨树的全花(花梗以上部分)，三棵试验树各30朵花，去除花瓣并将剩余部分从萼片和子房交界处分割成两部分，分别用锡箔纸包好，迅速投入液氮中保存，带回实验室置于-80℃超低温冰箱中备用。

1.2 方 法

1.2.1 库尔勒香梨kfpSPL的基因组DNA克隆

以天根公司新型植物基因组小型提取试剂盒说明书为依据进行库尔勒香梨基因组DNA的提取。使用试验已获得的库尔勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列及梨基因组信息为模板设计引物。上游引物为SPL1-S为5‘-TTGCTGCCTCCTACCCTG-3’，下游引物为SPL1-A为5‘-ACTTGCCAAACTAAACATC-3’。以库尔勒香梨基因组DNA序列为模板进行kfpSPL基因组DNA序列的扩增。其PCR反应体系为：10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μL，模板1 μL，上下游引物(20 μmol/L)1μL，LATaq酶(5 U/μL)0.25 μL，灭菌蒸馏水加至25 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30s；51℃退火30s；72℃延伸2 min；30个循环；72℃延伸10 min。

使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的结果，使用胶回收试剂盒回收PCR产物。回收的PCR扩增产物与pEASY-T1载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中、使用麦康凯培养基进行筛选，通过菌液PCR筛选阳性克隆产物，将菌液PCR扩增的阳性克隆产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果使用DNAMAN进行分析。

1.2.2 kfpSPL启动子片段的克隆

使用SPL基因cDNA全长与梨基因组数据库进行比对，获得SPL基因上游启动子参考序列。利用参考序列设计引物，以库尔勒香梨基因组DNA为模板经PCR扩增获得库尔勒香梨SPL基因上游约2 000 bp的序列。上游引物为SPL1-QDZ-S为5’-AAGGGCATGAACCATACGTACC-3’,下游引物为SPL1-QDZ-A为5’-TACCTGCCTTTAGCAGCGTT-3’。PCR反应体系同上，PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45s；53℃退火30s；72℃延伸2 min；30个循环；72℃延伸10 min。将PCR扩增产物片段连接到pEASY-T1克隆载体上，将已获得的重组质粒交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果使用DNAMAN进行分析。

1.2.3 序列分析

将测序得到的kfpSPL基因组DNA序列和启动子序列在梨全基因组序列数据库(http：//peargenome.njau.edu.cn)中进行比对，再在植物顺式调控元件数据库PLACE和PlantCare(http://bio_informatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中对启动子序列进行顺式作用元件预测分析。

2 结果与分析

2.1 kfpSPL基因的基因组DNA序列的克隆

使用引物SPL1-S和SPL1-A从库尔勒香梨基因组DNA中扩增得到长度约为3 000 bp的片段，该片段经过克隆、菌液PCR验证、挑选出阳性克隆，测序得到该片段长度为3 320 bp，与该基因的cDNA序列比较发现包含三段内含子，总长度为1 728 bp，第一段内含子位于基因组DNA的第407～949 nt处，第二段内含子位于第962～2 386 nt处，第三段内含子位于第2 530～2 673 nt处。

将获得的kfpSPL基因的基因组DNA序列在梨全基因组数据库中进行比对，发现该基因组DNA与Pyrus bretschneideri 数据库中的一段序列的同源性为99%，且二者长度相同，E值为0，该序列位于scaffold291.0中301 708～305 026 nt的位点上，而另一段与Pyrus bretschneideri 数据库中的一段序列的同源性为85%，且二者长度相同，E值为2.7，该序列位于scaffold291.0中300 845～300 878 nt的位点上。图1

图1 kfpPL基因启动子的PCR扩增

Fig.1 PCR production of kfpSPL gDNA(A)

2.2 kfpSPL基因启动子序列克隆

用kfpSPL基因的cDNA全长序列与梨基因组序列进行比对，获得kfpSPL基因上游启动子参考序列，根据比对后获得的启动子参考序列设计引物，通过PCR技术克隆获得上游启动子序列，经测序表明启动子长为2 332 bp。将克隆得到的启动子序列在梨全基因组序列数据库中进行比对，发现克隆得到的上游启动子序列的1～796 nt和1 042～2 332 nt分别与scaffold291.0中290 783～289 988 nt和289 990～288 701 nt的同源性为96%和97%，E值均为0。说明kfpSPL基因启动子序列与砀山梨scaffold291.0启动子序列存在一定的差异。其中位于kfpSPL基因的启动子序列的第797～1 041 nt处与梨全基因组数据库中未有比对上的相同序列，可能是因为库尔勒香梨与砀山梨的品种间差异造成的。在kfpSPL基因的启动子序列的第161～162 nt处发生插入突变，在1 345～1 350 nt处发生插入突变，在1 375～1 377 nt处发生插入突变，在2 129～2 137 nt处发生插入突变。并且在序列中多处有单碱基突变发生。图2

2.3 kfpSPL基因启动子序列

通过生物信息学分析kfpSPL基因的上游启动子序列，其预测的转录因子结合位点及其功能。生物信息学分析结果表明，库尔勒香梨kfpSPL基因的启动子序列中的TATA-box和CAAT-box基本转录原件也存在于其他多数启动子中，并分别位于kfpSPL基因启动子序列上的多个位点，从预测中还发现一些顺式调控元件，其中高转录水平的顺式调控作用元件为5UTR Py-rich stretch，与光调控相关的顺式作用元件ACE、Box 4、 Box II、G-box、CATT-motif和TCT-motif，与胁迫相关的顺式作用调控元件有ARE、TC-rich repeats、WUN-motif，与脱落酸响应有关的顺式作用调控元件是ABRE，与赤霉素响应有关的顺式调控作用元件是GARE-motif、P-box，与水杨酸响应有关的顺式调控作用元件是TCA-element，与分生组织表达相关的顺式作用调控元件是CAT-box，与茉莉酸响应有关的顺式作用调控元件是CGTCA-motif、TGACG-motif，与胚乳表达所需的顺式作用调控元件是Skn-1_motif，MYB结合位点参与干旱诱导MYB的调控元件是MBS。这些调控元件的存在说明kfpSPL基因受多种外界信号的调控，例如激素、光、胁迫等。通过一系列的生物学过程来调控kfpSPL基因特定的转录过程。库尔勒香梨kfpSPL基因的启动子含有赤霉素、水杨酸、脱落酸等较为常见的顺式作用元件，可以推断赤霉素、水杨酸、脱落酸等激素可能会调控kfpSPL基因的表达。表1，图3

图2 kfpSPL基因gDNA的PCR扩增

Fig.2 PCR production of kfpSPL promoter(B)

表1 应用 PLACE 和 Plant CARE 在线预测的启动子区顺式作用元件

Table 1 cis-acting regulatory elements analysis of promoter sequences by PLACE and plant CARE

调控序列名称Regulatory sequence name位置(链)Location(chain)序列Sequence位点功能Fuction of site5’UTR Py-rich stretch-432TTTCTTCTCT高转录水平的顺式作用元件cis-acting element conferring high transcription levelsAAGAA-motif-193GAAAGAABRE+1 155GCCACGTACA顺式作用元件参与脱落酸的反应cis-acting element involved in the abscisic acid responsivenessACE+910ACGTGGA光响应中的顺式作用元件cis-acting element involved in light responsivenessARE+108;-1 204;+1 020TGGTTT厌氧诱导必需的顺式作用调控元件cis-acting regulatory element essential for the anaerobic inductionAT-rich element+536ATAGAAATCAA在丰富的DNA结合蛋白的结合位点(atbp-1)binding site of AT-rich DNA binding protein (ATBP-1)ATGCAAAT motif+365ATACAAAT顺式调控元件相关联的tgagtca模体cis-acting regulatory element associated to the TGAGTCA motifBox 4-916;-927ATTAAT参与光响应的保守DNA模块的一部分part of a conserved DNA module involved in light responsiveness Box II+1 266TGGTAATAA光响应元件的一部分part of a light responsive elementCAAT-box+42等42个位点+42 ect,42sitesCAAT,CAATT,CCAAT启动子和增强子区的共同顺式作用元件common cis-acting element in promoter and enhancer regionsCAT-box+1 155GCCACT与分生组织表达相关的顺式作用调控元件cis-acting regulatory element related to meristem expressionCATT-motif-1 352GCATTC光响应元件的一部分part of a light responsive elementCGTCA-motif-1 478CGTCA顺式调控元件参与茉莉酸响应cis-acting regulatory element involved in the JAMe-responsivenessCTAG-motif+339ACTAGCAGAAAG-box+117;-678;-156;-678;-909CACATGG,TAAACGTG,CACGTC,CACGTT顺式作用调节元件参与光响应性cis-acting regulatory element involved in light responsivenessGARE-motif+144AAACAGA赤霉素响应元件gibberellin-responsive elementMBS+28;+1 272;-1 064GAACTG,TAACTGMYB结合位点参与干旱诱导MYB binding site involved in drought-inducibilityP-box+1431GCCTTTTGAGT赤霉素响应元件gibberellin-responsive elementSkn-1_motif+662GTCAT胚乳表达所需的顺式作用调控元件cis-acting regulatory element required for endosperm expressionTATA-box+15等28个位点+15 etc,28 sitesTATTTAAA,TATAAA,TATATAA,TATA,ATATAT,TATATAAATC,TTTTA核心启动子元件约30转录起始core promoter element around -30 of transcription startTC-rich repeats-434;-606ATTTTCTTCA防御和应激反应中的顺式作用元件cis-acting element involved in defense and stress responsivenessTCA-element-874GAGAAGAATA水杨酸反应中的顺式作用元件cis-acting element involved in salicylic acid responsivenessTCCACCT-motif+528TCCACCTTCT-motif+1 097TCTTAC光响应元件的一部分part of a light responsive elementTGACG-motif+1 478TGACG顺式调控元件参与茉莉酸响应cis-acting regulatory element involved in the JAMe-responsivenessUnnamed__1+911CGTGGUnnamed__3+911CGTGGUnnamed__4+217等12个位点+217 etc12sitesCTCCWUN-motif-899TCATTACGAA创伤响应元件wound-responsive element

图3 kfpSPL启动子序列TATA-BOX,CAAT-BOX(灰色标出)，部分预测顺式作用元件(黄色标出)

Fig.3 Sequence of kfpSPL gene promoter TATA-BOX and CAAT-BOX are black arrow.Part of the predicted cis-acting element is marked with a highlighted box

图4 kfpSPL基因组DNA序列，翻译起始密码子(红色粗体标出)，内含子(红色字体标出)，外显子(黑色字体)

Fig.4 Sequence of kfpSPL genomic DNA. The initial password of the translation is marked in bold red, The introns are highlighted in red, and the black font is exon

3 讨 论

前人研究表明，库尔勒香梨的脱萼果主要于初花期至盛花期形成，于末花期减弱[12],表明花期决定着果实果形的变化，这一研究与张大海等[13]研究结果一致。任莹莹等[14]认为，在初花期至花后两周，尤其是盛花期，喷施NAA、PBO和乙烯利可影响库尔勒香梨萼片宿存，其中喷施PBO可提高90%以上的脱萼率。由前人研究得知，使用PBO、ETH、NAA处理可增加库尔勒香梨萼片的脱落[15]，用GA处理可减少库尔勒香梨萼片的脱落[2]。使用ABA、ETH和NAA三种激素处理使得库尔勒香梨梨花kfpSPL基因的表达量上调，而用PBO和GA处理后kfpSPL基因表达量受处理时间和树势强弱的影响。kfpSPL基因很可能与库尔勒香梨萼片脱落与宿存的激素调控有一定的关系。

4 结 论

kfpSPL基因启动子序列中存在与赤霉素、脱落酸、水杨酸等激素相关的顺式作用元件，不同生长调节剂处理脱萼果和宿萼果的花器官可以调控kfpSPL基因的表达水平。在kfpSPL基因的启动子序列中可能含有对其在转录调控过程中起到重要作用的顺式调控作用元件，如脱落酸响应式顺式调控作用元件ABRE，赤霉素响应顺式作用调控元件GARE-motif和P-box，水杨酸响应顺式作用调控元件TCA-element，而这三种激素处理可能影响库尔勒香梨萼片的脱落和宿存。