红枣黑斑病拮抗细菌JK1产芽孢培养基的优化

王 宁，侯 敏，房世杰，艾尼江·尔斯满，侯新强，杨 蓉，包慧芳

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院科研管理处，乌鲁木齐 830016)

0 引 言

【研究意义】植物在其生长发育过程中遭受其它生物侵染或非生物的不利因素影响，使其生长发育受到阻碍，导致产量降低、品质变差甚至植株死亡的现象称为植物病害。长期以来，频繁使用化学杀菌剂使植物病原菌在易产生抗药性的同时还会造成环境污染。因此，植物病害的防治措施正逐渐从单纯依赖化学防治转向与环境友好、经济效益较高的生物防治协同调控，筛选性能优良、稳定性好的微生物菌种目前也成为植物保护领域的研究热点[1-3]。【前人研究进展】多粘类芽孢杆菌( Paenibacillus polymyxa) 具备产生肽类、蛋白质类、核苷类等多种抗菌物质的优良特性[4-6]，并可以从根际土壤向植物根部移动定植，是一种兼具防病和促生作用的生防菌[7]。芽孢具有耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂等特性，是菌剂应用的理想剂型[9]。为后续田间试验奠定基础急需解决本菌剂在制备过程中存在的发酵菌落数偏低、芽孢生成率较低等问题，但优化培养基组成是一个长期复杂的过程，会涉及大量的数据分析处理。响应面分析是一种优化过程的综合技术，采用该法可以建立连续变量曲面模型，已被成功应用于培养基和培养条件的优化实验[10,11]。【本研究切入点】从新疆红枣黑斑病高发枣园土壤中分离到一株高效拮抗细菌JK1，鉴定为多粘类芽孢杆菌，生测结果表明，该芽孢杆菌能显著抑制链格孢属病原真菌生长，具有广谱的抗菌活性[8]。研究采用响应面法对红枣黑斑病的拮抗细菌JK1培养基进行优化。【拟解决的关键问题】对多粘类芽孢杆菌的产芽孢培养基进行优化，利用响应面法，对影响产芽孢过程的培养基因子水平及其交互作用进行评价。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种

多粘类芽孢杆菌(JK1) 由实验室保存。

1.1.2 主要仪器、试剂

MSSPX-250 型生化培养箱，SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台，MLS-3020 高压蒸汽灭菌锅，pHS-3C 酸度计，恒温摇床，岛津电子天平，控温水浴锅。

麦芽浸粉、大豆蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化钠(NaCl)、硫酸镁( MgSO4)、磷酸二氢钾( KH2PO4)、琼脂等。

1.1.3 培养基

菌种活化培养基( LB 培养基) : 牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。

发酵基础培养基: 葡萄糖 10 g，酵母粉10 g，NaCl 1 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.05 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。

1.2 方 法

1.2.1 培养

1.2.1.1 菌种活化

将已保存的多粘类芽孢杆菌菌种接至活化培养基，35℃培养24 h备用。

1.2.1.2 种子液制备

取一环活化菌种，接入装有200 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，35℃,150 r/min培养16 h。

1.2.1.3 摇瓶培养[12]

分别取4 mL种子液接入装有200 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中(接种量为2%)。置35℃150 r/min摇床中振荡培养，进行后续发酵条件优化研究。

1.2.2 芽孢率测定

将菌液培养 24 h 后，每隔4 h 测定一次活菌数及芽孢数，确定最佳培养时间。芽孢率的测定方法为:80℃ 水浴加热 15 min 后，用稀释涂布法检测芽孢生成量。

1.2.3 抑菌圈测定[13]

制作PDA双层培养基，上层加入红枣黑斑病病原菌，利用牛津杯法测定效价。具体方法为：发酵液10 000 r/min离心5 min，取50 μL上清液加入牛津杯，28℃培养4 d后十字交叉法测抑菌圈直径。

1.2.4 最佳碳源确定

用1%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉和麦芽浸粉作为菌株碳源，进行摇瓶发酵培养，35℃,150 r/min培养48 h，80℃水浴后用稀释涂布法检测芽孢生成量。

1.2.5 最佳氮源确定

用1%的牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸钾作为菌株氮源，进行摇瓶发酵培养，35℃,150 r/min培养48 h，80℃水浴后用稀释涂布法检测芽孢生成量。

1.2.6 Plackett-Burman试验

应用设计软件，对初始发酵培养基中的主要成分(6个实际因素)，5个虚拟因素进行试验分析，采用试验次数N = 12的Plackett-Burman设计，对11个因素进行考察，响应值 Y 为菌体芽孢数。将各因素显著性排序，从而得到影响菌体芽孢数的3个主效应因素。

1.2.7 最陡爬坡试验

通过Plackett-Burman设计确定影响菌株产芽孢的显著性因素，然后通过各显著性因素的正负效应决定下一步最陡爬坡实验的爬坡路径，包括变化方向和变化的步长，在有限实验次数内快速逼近曲面的稳定点区域。

1.2.8 响应面分析

根据二水平设计结果，选出影响最大的三个因素作为考察因素，采用 Box-Behnken 中心组合实验设计，各取3水平，设计14个实验点，其中12个分析点，2个为对照，进行响应曲面分析方法对培养成分进行优化。

1.3 数据处理

试验设计及数据分析由Design-Expert8.05软件完成。

2 结果与分析

2.1 最佳碳源确定

碳源是菌体碳架构成及能量供应的来源。常用速效碳源及长效碳源对JK1芽孢产量的影响。48 h后检测芽孢生成量，研究表明，麦芽浸粉为最适碳源，其次效果较好的依次为葡萄糖、果糖及可溶性淀粉。进入发酵稳定期后，麦芽浸粉最利于JK1芽孢数量的积累，但速效碳源通常会使菌体营养生长阶段较快完成，且葡萄糖发酵的芽孢生成量也较高，因此，将葡萄糖及麦芽浸粉确定为JK1芽孢生成的速效碳源及长效碳源用于后续实验。图1

图1 不同碳源下JK1产芽孢变化

Fig.1 Influence of different carbon sources on the spore production of JK1

2.2 最佳氮源确定

选择1%的牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸钾作为菌株氮源，进行摇瓶发酵培养。研究表明，有机氮源富含各种氨基酸和微量元素，对菌体生长代谢可能有较大促进作用，明显有利于JK1芽孢的生成，无机氮源下芽孢几乎无生长或生长缓慢，经测定，大豆蛋白胨为氮源时JK1芽孢生长最佳。图2

图2 不同氮源下JK1产芽孢变化

Fig.2 Influence of different nitrogen sources on the spore production of JK1

2.3 Plackett-Burman 试验设计优化

通过两水平的Plackett-Burman 试验设计，进行一阶优化。选用实验次数 N=12的实验设计，对麦芽浸粉(X1)、葡萄糖(X2)、大豆蛋白胨(X3)、NaCl(X4)、K2HPO4(X5) 、MgSO4(X6)6个因素进行考察，每项均取高(1)、低(-1)2水平，响应值为多粘类芽孢杆菌芽孢数 (Y)。表1

利用Design expert软件对PB实验进行方差分析，JK1各因素影响结果显示。麦芽浸粉、葡萄糖、NaCl的P值分别为0.000 2、0.048 5、0.033 5均小于0.05，说明麦芽浸粉、葡萄糖、NaCl对JK1产芽孢的影响显著。其它3个因素P值均大于0.05，说明对JK1产芽孢影响不显著，后续培养基优化取平均值。表2

表1 Placket-Burman 设计

Table 1 Plackett-Burman design

试验号GroupingX1X2X3X4X5X6芽孢Spore count111-11-1-120.72111-1-1-119.33-1-1-1-1-1-118.441-1-1-11-121.151-11-11121.66-1-1111-118.47-111-1-1115.8811-111121.39-11-1-11117.910-11111-118.111-1-1-11-1118.0121-111-1120.6

表2 Plackett-Burman 设计因素水平及显著性

Table 2 Plackett-Burman design factor and significance level

因素Element (g/L)水平 Level-11系数估计Coefficient estimateF值F ValueP值Prob>F重要性OrderX1麦芽浸粉10156.0087.280.000 21X2葡萄糖11.5-16.676.730.048 53X3大豆蛋白胨1015-1.203.490.120 64X4NaCl11.518.678.450.033 52X5K2HPO40.20.350.002.420.180 25X6MgSO40.50.75-5.330.170.695 26

2.4 最陡爬坡实验

由 Plackett-Burman 实验可知，在待优化培养基中，麦芽浸粉、NaCl、葡萄糖这3个因素对产孢有重要的影响，培养基中各变量的系数估计值，该系数决定了爬坡的方向。其中麦芽浸粉和NaCl有显著正效应，应增加；葡萄糖有显著负效应，应减小。根据3个因素效应大小的比例设定步长进行实验。最优培养条件在处理3与处理4之间，故以处理4的条件，即麦芽浸粉(A)22.5 g/L、葡萄糖(B)0.6 g/L、NaCl(C)3 g/L为响应面实验的中心点。表2，表3

表3 最陡爬坡实验

Table 3 Design and results of the steepest slope experiment

试验号GroupingX1(g/L)X2(g/L)X3(g/L)芽孢数Spore count115.01.20.519.66217.51.0121.77320.00.8228.07422.50.6333.25525.00.4429.72

表4 响应面因素水平

Table 4 Analysis factor levels of response surface methodology

水平Level因素 ElementABC-1 Low200.420 Center22.50.631 High250.84

2.5 响应面试验设计确定显著影响因子最佳值

采用Box-Benhnken 的中心组合实验设计，建立3因素 3水平的响应面分析实验，共15个实验点。给出的实验结果显示，15个实验点可以归分为2类，一类为析因点，即自变量取值在A、B、C三项构成的三维顶点上，共有12个析因点；第二类为零点，即区域的中心点，零点试验要重复3次，用来判定试验误差[14]。以芽孢产生量为响应值，根据表5的试验结果进行多元回归分析。经回归拟合后，实验因子对响应值的影响可用回归方程表示为：Y=45.00+5.14A-1.00B -1.89C+0.053AB- 0.35AC+0.085BC-2.31A2-2.82B2-3.42C2。表4，表5

表5 响应面试验

Table 5 Design and results of response surface methodology

试验号GroupingABC芽孢数Actual value预测值Predicted value10-1137.4637.7721-1045.3545.96301135.2835.94401-139.8739.56500045.3045.00600045.0445.007-10-134.7435.66810143.0942.17911043.8044.06100-1-142.3941.731110-146.6046.651200044.6545.0013-11034.2833.6714-10132.6332.5815-1-1036.0435.78

表6 响应面试验方差

Table 6 variance analysis of response surface methodology

试验号Grouping自由度df平方和Sum of Squares均方Mean SquareFP模型 Model9329.4136.6047.180.000 3A1211.67211.67272.81< 0.000 1B18.028.0210.340.023 6C128.6528.6536.930.001 7AB10.0110.0110.0140.909 8AC10.490.490.630.462 8BC10.0290.0290.0370.854 6A2119.6519.6525.330.004 0B2129.4129.4137.900.001 6C2143.3043.3055.810.000 7失拟Lack of Fit33.671.2211.410.081 6

3D图形可形象展示响应值和实验参数水平之间的关系，通过上述回归方程作响应曲面图形。可知当一个实验因子变量浓度不变时，响应值均会随另两个变量浓度的增大呈现先增后减趋势，且曲面存在最高稳定点。根据方程求一阶偏导得Y的极大值是在：A=1.000，B=-0.174，C=-0.329，也就是麦芽浸粉、葡萄糖、NaCl分别为25.00 g/L、0.57 g/L、2.7 g/L时多粘类芽孢杆菌JK1产芽孢数量为4.83×109CFU/mL。在该条件下，对模型预测值进行实验验证，重复三次后平均结果为4.92×109CFU/mL，说明该实验选用的模型是合理的。图3～5

图3 麦芽浸粉和葡萄糖浓度对芽孢产量影响的响应面

Fig.3 Response surface map of malt extract and glucose concentration on the yield of spore

图4 麦芽浸粉和NaCl浓度对芽孢产量影响的响应面

Fig.4 Response surface map of malt extract and NaCl concentration on the yield of spore

图5 葡萄糖和NaCl浓度对芽孢产量影响的响应面

Fig.5 Response surface map of glucose and NaCl concentration on the yield of spore

2.6 优化后发酵液的抑菌效果

优化前发酵液抑菌圈直径为24.5 mm，优化后发酵液抑菌圈直径为30 mm。优化后较优化前增加22.4%，证明优化后的发酵液不仅提高芽孢生成率还产生了更多抑菌物质。图6

图6 优化前(左)、后(右)的发酵液拮抗效果

Fig.6 Contrast of antagonistic effect before(left)and after(right)optimization

3 讨 论

安全、无污染的有益微生物农药、肥料等农业投入品的研究正逐渐受到人们重视[15]。研究表明，生防细菌JK1在离体条件下对枣树黑斑病病原菌可产生明显抑制效果，在新疆林果业极具应用前景。但考虑到生防因子的复杂性，后续还要完善拮抗赋分系统，结合定殖力、产蛋白酶、纤维素酶、噬铁素等能力高效筛选优良生防菌株。

由于芽孢没有新陈代谢，能经受多种环境伤害，具有广阔的应用前景。着重关注JK1产芽孢的能力，而目前对产芽孢培养基的报道并不多见。从高度非线性、非结构化的复杂系统中要获得最佳工艺，试验优化技术具有很重要的作用[,16,17]。响应面优化设计法通过拟合多因素与响应值间的全局函数关系，有助于快速建模，摇瓶条件下使JK1的产芽孢能力提高3.4倍，通过后期的发酵验证，表明该方法不仅可以缩短优化时间，应用可信度也较高。

4 结 论

通过单因素实验确定了JK1产芽孢培养基的最佳长效碳源、速效碳源及氮源分别为：麦芽浸粉、葡萄糖、大豆蛋白胨。利用响应面法分三个步骤对JK1的摇瓶培养基进行优化。利用Plackett-Burman试验设计法确定影响产芽孢培养的主要营养要素，用最陡爬坡法确定主要因素的中心点，接着采用BBD中心组合实验确定JK1发酵主要因素的最佳水平。对中心组合实验结果进行分析，利用因素系数建立二次回归方程，由一阶偏导得出因素极大值，确定JK1最佳产芽孢培养基组成：麦芽浸粉 25.00 g/L、葡萄糖 0.57 g/L、大豆蛋白胨 12.5 g/L、NaCl 2.7 g/L、K2HPO40.25 g/L 、MgSO40.625 g/L。最优产芽孢培养基可将JK1的芽孢数从初始的1.12×109CFU/mL提高到4.92×109CFU/mL。