环状RNA与肿瘤研究进展

宋东强，史冬敏，张顺财

1.复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032 2.复旦大学附属中山医院消化科，上海 200032

近期，Science、MolecularCell杂志分别报道了环状RNA(circular RNA, circRNA)的最新研究成果[1-2]，使circRNA重新受到广泛关注。circRNA是一类普遍存在于真核细胞基因组中，具有基因调控作用的内源性RNA。20世纪70年代，circRNA首次在病毒中被发现[3]，随后在酵母线粒体中被找到[4]。在过去近30年内，circRNA被证实存在于病毒、古生菌、植物和人体细胞等多种生物体内[5-9]。但其一直被认为是在转录过程中错误剪接而形成的副产物，无重要生物学功能。

近年来，随着生物物理学、RNA测序技术和生物信息学等技术的快速发展，高通量、长读段为特征的大量转录组数据被发现，生物体中越来越多的 circRNA随之被发现。Memczak等[10]通过RNA-seq数据结合人白细胞数据库，在人类、小鼠及线虫中分别鉴定出1 950种、1 903种和724种circRNA(其中小鼠与人类有81种circRNA相同)，并成立了1个circRNA数据库(http://www.circbase.org/)，可在线查询。Liu等[11]通过检测464例人RNA-seq样本的全转录组，鉴定了circRNA的表达谱(包含已知和新发现的circRNA)，并在此基础上建立了目前第1个提供组织特异性的circRNA表达谱以及circRNA-miRNA基因调节通路的公共数据库，即CircNet Database (http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/)。上述研究使人们认识到基因外显子可3′端和5′端共价连接形成环状结构的circRNA在真核细胞内表达丰富且稳定，这种结构能抗RNA外切酶降解。

1 circRNA的形成

关于circRNA的形成机制尚无定论，目前主要有2种机制。(1)在转录过程中，前体mRNA(pre-mRNA)中的外显子转录本被非线性地反向剪接形成circRNA，分为套索驱动的环化和内含子配对驱动的环化(图1A,1B)。这种circRNA被称为外显子来源的circRNA[12-13]。(2)另外一种理论认为内含子也可以形成circRNA。Zhang等[14]提出了内含子自身环化(图1C)，这类由内含子自身环化形成的circRNA被称为内含子circRNA。

图1 环状RNA形成示意图

A：内含子配对驱动的环化[15]；B：套索驱动的环化[15]；C：内含子自身环化[14]

2 circRNA的特征

circRNA的主要特征包括：(1)circRNA广泛存在于多种真核生物中，包括人类[16-18]；(2)主要位于细胞质，少数位于细胞核[14]，非常稳定，不易被核酸外切酶RNaseR降解[10,16,19]；(3)大部分circRNA具有高度保守序列[16,18]；(4)circRNA主要来源于外显子，内含子来源circRNA及由外显子和内含子共同组成的 circRNA则较少[10,16,19-20]；(5)有些circRNA具有微小RNA(microRNA，miRNA)结合位点，能与miRNA相互结合，从而调控靶基因的表达[6,16]；(6)大部分通常不编码蛋白，属于非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)[16]；(7)主要在转录及转录后水平发挥调控作用[14,19]；(8)少量circRNA可以翻译成蛋白质[21]。

3 circRNA与肿瘤的相关性

circRNA的miRNA海绵作用使其能通过竞争性吸附内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)调控基因表达[10, 22]，具体表现为circRNA通过结合miRNA来阻断其对特异靶mRNA的抑制作用，从而调控miRNA靶基因的表达水平[23]。此外，circRNA还能够作为转录后调控因子，调控RNA表达[23]、蛋白质活性[10, 22]等功能。

3.1 ciRS-7/CDRlas作用机制 circRNA可以通过多个途径影响肿瘤的进程。ciRS-7/CDRlas是目前研究较多的一种circRNA，其miR-7结合位点超过70个；ciRS-7/CDRlas通过结合miR-7抑制miR-7的活性[10]，进而调控miR-7靶基因的表达[22]。而miR-7涉及多种生物学通路，可直接作用于肿瘤发生的相关靶基因，调控肿瘤因子的表达。

大量研究[24]表明，miR-7对肿瘤具有明显的抑制作用。在肿瘤增殖及转移研究中，miR-7通过靶向作用于黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)的3′非编码区，负向调节其表达水平，阻断乳腺癌细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程，进而抑制了癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[24]。PAX6是表达于结直肠癌细胞的高度保守的转录因子，其通过激活ERK/PI3K信号通路，上调基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达水平，促进结直肠癌的进展；PAX6也是miR-7的直接靶标，两者表达负相关，miR-7能下调PAX6的表达，抑制结直肠癌的生长、增殖、转移[25]。Fang等[26]发现，miR-7可以靶向作用于苏氨酸激酶(Akt)，负性调节PI3K/Akt信号通路，从而将肝癌细胞周期阻断在G0/G1期。在舌鳞癌中，miR-7促使胰岛素生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) 下调，从而削弱IGF1诱导Akt活化的能力，进而阻断细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡[27]。在乳腺癌MDA-MB-468、肺癌A549细胞及胶质母细胞瘤DU145中，miR-7能显著降低表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor protein，EGFR)的表达水平，从而抑制肿瘤细胞周期,基因芯片进一步发现，癌基因Raf1、蛋白激酶B(PKB)及细胞外信号调节激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)的下降[28]。但是，miR-7也有促癌作用。如病毒致癌基因E6/E7在HPV阳性的HeLa细胞系中的表达水平与miR-7正相关[29]。Nakagawa等[30]发现，miR-7在人结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常黏膜。因此，ciRS-7/CDRlas通过调控miR-7水平而调节肿瘤增殖及转移等。

3.2 消化道恶性肿瘤 Bachmayr-Heyda等[31]通过对31对人结肠癌组织和相应的癌旁组织进行RNA测序，发现circRNA的丰度显著低于对应的正常结肠组织。Li等[32]通过检测101对胃癌及癌旁组织标本中hsa_cir_002059的表达水平及其与临床病理学特征的相关性，发现该circRNA在胃癌组织中表达下调，且与TNM分期以及远处转移相关，提示hsa_cir_002059可作为胃癌诊断的一个潜在分子标志物。另外，Li等[33]分别对358、326对人食管癌和对应的癌旁组织进行qRT-PCR检测，结果发现，cir-ITCH在食管癌的表达水平显著低于癌旁组织，且差异有统计学意义。cir-ITCH通过海绵吸附miR-216b、miR-17、miR-214、miR-7和miR-128，间接提高miRNA靶基因ITCH的表达水平，而高表达的ITCH能够促进磷酸化Dvl2的泛素化和降解，通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤细胞的增殖[33]。

3.3 肝细胞肝癌 Qin等[34]发现，hsa_circ_0001649在肝癌细胞中明显下调，其表达与肿瘤大小明显负相关(P=0.045)，同时发现hsa_circ_0001649的表达与癌栓形成相关。在细胞实验中，用siRNA下调肝癌细胞系HCC-LM3和MHCC-97L中的hsa_circ_0001649，MMP9、 MMP10和MMP13的mRNA表达水平显著上升，表明hsa_circ_0001649可能与肝癌转移密切有关。Huang等[35]应用基因芯片技术分别检测了肝癌及癌旁组织circRNA的表达差异，发现与癌旁组织相比，肝癌组织中有226个circRNA的表达有明显差异，其中189个上调、37个下调；通过qRT-PCR进一步验证发现，hsa_circRNA_104075和 hsa_circRNA_100338明显上调。Huang等[35]进一步在临床上选择了80例乙肝相关的肝细胞肝癌患者的肝癌组织样本，选择表达明显升高的hsa_circRNA_100338作为检测目的基因，发现癌组织及癌旁组织均有circRNA_100338表达，且circRNA_100338低表达组的累计生存率(72%)明显高于高表达组(42.9%)；circRNA_100338表达与TNM分期、血管侵袭和肺转移明显相关，circRNA_100338可以作为乙肝相关肝癌预后评价的生物标志物。

circRNA还有可能通过调控肝癌细胞细胞周期促进肿瘤进展。Ren等[36]应用Arraystar Human circRNA Array 和Arraystar Human mRNA Array芯片分析肝癌组织的circRNA和mRNA，发现127个circRNA(113上调、14下调)和3 235个mRNA(1 923个上调、1 312个下调)的表达有显著差异。通过KEGG Pathway分析和GO 分析3 235个mRNA发现，表达上调的mRNA主要参与细胞周期及细胞分裂，而下调基因与各种代谢过程有关。该研究选择了5个上调最显著的circRNA作为研究对象，通过miRNA数据库预测circRNA与miRNA 的相互作用，构建circRNA-miRNA-mRNA网络。GO富集分析发现，这些mRNA参与肿瘤相关信号通路，如p53信号通路、血管生成和细胞周期信号通路。为了验证预测结果的准确性，Ren等[36]进一步在40例肝癌组织样本中，应用qRT-PCR分析这5 个circRNA的表达水平，发现与癌旁组织相比，肝癌组织中circZFR、circFUT8和circPO11表达水平显著升高，与芯片分析结果一致，说明circZFR、circFUT8和circPO11可作为肿瘤诊断及治疗新的生物标志物。

3.4 其他肿瘤 类似的生物信息学技术同样在其他肿瘤[37-39]中得到广泛应用。越来越多的肿瘤，如肺癌[40]、口腔鳞癌[41]中发现了circRNA的表达，且参与多种信号通路的调控，为肿瘤的早期诊断及治疗提供新的依据及治疗靶点。

4 问题与展望

肿瘤是严重威胁人类生命健康的恶性疾病。由于癌症的复杂性，人们对癌症发生和发展机制的认识还不能满足对其防、诊、治的需求。因此，深入解析癌症发生发展的分子机制和调控规律，进而研发癌症的早期检测、分子分型和预后预测方法及新型治疗药物等，是生物医学研究的重要任务。随着新一代RNA测序技术和生物信息学技术的发展，circRNA在越来越多的肿瘤中被发现，且对各种肿瘤中circRNA的结构、功能有了更深入的理解。circRNA表达稳定、半衰期长，同时在不同肿瘤中特异表达等特点，使其可能成为新的肿瘤标志物应用于肿瘤的早期诊断和筛查。同时，circRNA表达与肿瘤生物学特性密切相关，使其可能成为肿瘤个体化治疗及靶向治疗等新药研发的新靶点,将来可以通过人工合成circRNA的方式将其应用于肿瘤的靶向治疗。但circRNA仍有很多未知功能有待进一步研究，其临床适用性也需要进一步探索。