循环microRNA-21水平在预测冠状动脉侧支循环形成中的作用*

廖清池，胡艳丽，周胜华

(1.扬州大学附属苏北人民医院心内科，江苏扬州 225001；2.中南大学湘雅二医院心内科，湖南长沙 410000)

冠脉侧支循环形成过程即为动脉血管新生的过程，可为冠脉闭塞患者提供替代的冠脉灌注途径，冠脉侧支循环发展良好的冠心病患者保留有更好的心脏功能，更少受不良心血管事件的影响，病死率亦更低，因此冠脉侧支循环在冠心病慢性闭塞(CTO)患者中具有重要的临床意义。microRNA是一类非编码单链小分子RNA，通过mRNA转录后抑制或诱导其降解调节基因表达。资料表明microRNA可作为区分患者是否患有心血管疾病的生物标志物，这类疾病主要包括心力衰竭，稳定性心绞痛及急性心肌梗死，然而至今有关microRNA与冠心病侧支循环的关系研究仍鲜有报道[1]。microRNA-21(miR-21)已被证实为多种肿瘤的生物标志物，近来研究表明其在促进血管新生中亦起重要作用[2]。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是缺氧条件下诱导产生的一种转录因子，参与机体对缺氧的反应，研究表明亦有促进血管新生的作用。研究表明miR-21可调控HIF-1α的表达[3-4]。本研究主要探讨不同侧支循环的CTO冠心病患者中循环miR-21表达的差异，并进一步明确miR-21是否可作为预测冠脉侧支循环是否良好的生物标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2012年8月至2017年8月在本院住院治疗的冠心病患者95例，男60例，女35例，年龄40～79岁(55.7±17.2)岁，均行冠脉造影证实前降支、回旋支或右冠状动脉至少有一支为CTO病变，根据冠脉侧支循环是否良好分为侧枝良好组53例，侧枝不良组42例，所有患者均有超过4周的心绞痛症状，符合冠心病诊断标准。排除标准包括：既往心肌梗死、心脏外科手术、左心功能不全、糖尿病、急慢性炎症、冠状动脉心肌桥、瓣膜性心脏病、周围血管疾病、血液系统疾病、脑血管疾病、肿瘤及重要脏器严重功能障碍等。排除糖尿病主要因其对冠脉侧支循环及microRNA表达有潜在影响[5-6]，因此排除此类患者有利于明确microRNA表达水平与冠脉侧支循环的关系。选取同期行冠脉造影正常的住院患者30 例作为对照组，男19例，女11例，年龄39～79(56.3±18.1)岁。 各组患者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。同时收集其他一般临床资料，主要包括高血压、高脂血症病史、吸烟史及相关用药史[如拜阿司匹林、氯吡格雷、他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ACEI/ARB)、钙通道阻滞剂(CCB)、硝酸酯类药物、倍他乐克、低分子肝素等]，上述指标在CTO两组患者中比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过本单位伦理委员会批准，所有研究对象均书面知情同意。

1.2方法

1.2.1冠状动脉侧支循环情况评估 根据冠脉侧支循环Rentrop分级标准[7]评估冠状动脉侧支循环:0 级为未见侧支循环；1 级为分支冠脉充盈，但主要的心外膜冠脉未见显影;2级为主要心外膜冠脉部分充盈；3级为主要心外膜冠脉完全显影。0、1级者为冠脉侧支循环功能不良组(42例)，而2、3 级者为冠脉侧支循环功能良好组(53例)。

1.2.2miR-21、HIF-1α 表达水平检测及白细胞计数 各组患者在行冠状动脉造影术前，于主动脉根部抽取血样本10 mL，注入事先准备好的无菌柠檬酸盐试管中，然后置入冰中，并以1 500×g离心20 min，血浆储存于-80 ℃无RNA酶的小瓶中待用。实时荧光定量PCR法测定血浆miR-21相对表达水平，ELISA 法测定血浆HIF-1α水平，计算白细胞、单核细胞及淋巴细胞总数。

2 结 果

2.1两组白细胞、淋巴细胞及单核细胞计数比较 侧支循环良好组单核细胞计数较侧支不良组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组白细胞、淋巴细胞及单核细胞计数的比较

a：P<0.05，与侧支不良组比较

2.2两组血miR-21、HIF-1α表达水平比较 侧支良好组较侧支不良组血浆miR-21、HIF-1α表达水平明显升高；CTO组miR-21、HIF-1α表达水平较正常对照组减少，差异有统计学意义 (P<0.05)，见表2。

表2 各组血miR- 21、HIF-1α水平比较

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与侧支不良组比较

2.3冠心病患者侧支循环形成的影响因素 相关分析显示血浆miR-21表达水平与 HIF-1α表达水平及单核细胞计数呈正相关 (r=0.804，P<0.05；r=0.784，P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示miR-21(OR=4.762，95%CI为2.395～6.164，P<0.05) 及 HIF-1α水平(OR=12.906，95%CI为11.774～15.048，P<0.05) 是CTO患者侧支循环形成良好的预测因子。

2.4血浆miR-21预测效能 根据Logistic回归分析的概率值绘制ROC曲线，AUC为0.93(95%CI0.79～0.95，P<0.05)，应用血浆 miR-21表达水平预测CTO患者侧支循环形成的灵敏性及特异性分别为87.5%、94.1%。

3 讨 论

近年来miR-21调节血管新生的作用已成为研究热点。研究发现在常氧条件下miR-21可抑制内皮细胞介导的血管新生[8]，而其他研究人员在肿瘤细胞中研究发现miR-21通过激活Akt信号促进血管新生[9]，因此miR-21在不同的细胞类型中发挥血管新生的调节作用不同。既往研究证实miR-21可显著缩小急性心肌梗死患者心肌梗死面积，表明miR-21在缺血缺氧环境中可促进血管新生。其机制可能与miR-21作用于10号染色体q23有缺失且与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)有关，因后者可以抑制Akt的活化，而Akt活化可促进血管新生。因此miR-21可通过PTEN/Akt信号途径促进缺血缺氧性血管新生。

尽管目前研究表明miR-21与血管新生的关系密切，但鲜有临床研究报道miR-21与冠脉侧支循环功能程度有关。本研究表明miR-21水平在侧支循环良好的CTO患者血浆中表达明显增加，并进一步证实miR-21可作为血浆循环标志物用来区分CTO患者侧支循环是否良好(灵敏性及特异性分别为87.5%、94.1%)。有趣的是与冠脉造影正常患者相比，CTO患者血浆中miR-21表达明显减少，提示miR-21可能是CTO冠心病患者的不利因素。

目前microRNA表达水平与冠心病冠脉侧支循环功能关系如何知之甚少，本研究假定冠心病患者中侧支循环功能程度不同，其血浆中miR-21表达水平亦不同，结果证实miR-21表达水平与冠脉侧支循环程度呈正相关，miR-21可用来区分冠心病患者冠脉侧支循环功能是否良好，其水平升高提示冠脉侧支循环功能良好，这一点在识别并发急性冠脉综合征高风险患者显得尤为重要。资料表明侧支循环丰富的冠心病患者有利于改善其生存率[10]，令人遗憾的是目前尚缺乏循环标志物来区分这类高风险患者。由于miR-21在患者血浆中表达稳定，有明显组织特异性，而且随所处环境反应快速，本研究证实在预测CTO患者冠脉侧支循环情况时其敏感度及特异度均较高，因此miR-21作为简单易测的生物标志物可用来预测冠脉侧支循环是否良好，有利于指导高危冠心病患者的治疗及改善其预后。

循环中白细胞尤其是其中的单核细胞在冠脉侧支循环中起重要调节作用，研究表明冠脉侧支循环功能良好与血液循环中低水平的白细胞总数及高水平的单核细胞有关[11]，本研究结果表明冠脉侧支循环良好组单核细胞明显升高，与前述研究一致，进一步行相关分析发现miR-21与循环中单核细胞存在明确正相关，推测其机制可能与单核细胞分泌miR-21有关[12]。此外有研究发现淋巴细胞计数与冠脉侧支循环功能是否良好相关[13]，本研究显示淋巴细胞计数及白细胞总数在冠脉侧支循环良好组及不良组间比较均无明显差别，这可能与本研究选择CTO冠心病患者作为研究对象有关。HIF-1α在缺氧条件下有促进血管新生的作用。资料表明HIF-1α可诱导血管内皮生长因子(VEGF)表达而缩小心肌梗死面积。研究显示HIF-1α表达受miR-21调控[3]，其机制可能与激活Akt信号途径有关，而后者可促进VEGF的表达。有资料表明在缺氧环境下抑制miR-21可导致心肌细胞HIF-1α表达减少[4]。本研究结果显示HIF-1α是冠脉侧支循环的影响因素，而且miR-21与HIF-1α呈正相关，因此推测在CTO冠心病患者中miR-21通过上调HIF-1α表达而促进冠脉侧支循环形成。此外，研究表明HIF-1α可通过上调miR-19a促进单核细胞水平上调及冠状动脉粥样硬化发生[14]，本研究亦发现HIF-1α与单核细胞计数呈正相关，因此HIF-1α发挥影响冠脉侧支循环的作用可能部分是通过增加血浆中单核细胞计数实现的。

目前明确冠脉侧支循环功能情况主要依靠冠脉造影等侵入性检查方法，而冠脉造影亦仅仅提供一种半定量方法来评估冠脉侧支循环功能情况，而且只能探测100 μg以上的血管。因此利用循环标志物如本研究中证实的miR-21因其简单易操作且无创的方式来区分冠心病患者冠脉侧支循环情况就显得十分有价值。考虑到那些冠脉侧支循环功能不良的冠心病患者有更高并发急性冠脉事件的风险及更高的死亡率，因此采用简单无创的方法有效识别这类患者非常重要。本研究表明miR-21可作为血浆循环标志物有效区分CTO冠心病患者冠脉侧支循环功能是否良好，但其具体作用机制尚不明确，因此将来的研究应纳入更多的患者群体以进一步明确miR-21在冠脉侧支循环中的作用并进行基础研究探讨其作用机制。