重组hIL-10联合威灵仙总皂苷对AA大鼠关节影像的影响及机制*

王 斌,张 燕,金苏华,珍 妮

(内蒙古林业总医院：1.医学影像科；2.眼科；3.医学影像科核磁共振室，内蒙古牙克石 022150)

类风湿性关节炎是一种以骨关节损伤为主要表现的疾病。佐剂性关节炎大鼠(AA大鼠)是目前较为公认的一种该病模型[1]。类风湿性关节炎存在难以治愈，疾病进展无法逆转的特点，因此找到一种能有效延缓疾病进展甚至治疗该病的治疗方法十分重要[2]。威灵仙总皂苷是一种从传统抗风湿药物威灵仙中提取出来的有效成分，有研究显示其对于AA大鼠的关节存在保护作用[3]。hIL-10也常常被应用于AA大鼠的研究中，很多研究提示其也对于AA大鼠骨关节保护和免疫调节存在比较好的效果[4-5]，但是少见将上述两种药物联合用于干预AA大鼠的报道，因此本研究正是基于此而进行的，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验对象处理方法 150只SPF级雄性大鼠分为空白组、对照组、观察组1、观察组2、观察组3，每个小组30只。所有大鼠在入组前首先适应性饲养5 d，不计入实验时间。适应性饲养完成后开始计算实验时间。空白组大鼠不接受任何处理。对照组和3个观察组先接受造模干预。具体方法为：(1)80 ℃灭活卡介苗，然后加入弗氏完全佐剂10 mg/mL，作为造模药品。(2)将上述药品1 mL用皮下注射的方式注入大鼠左前足底，加强免疫后15 d造模成功。造模结束后对照组大鼠不接受其他干预。观察组1：从第15天开始接受200 mg威灵仙总皂苷灌胃治疗，每天1次[6]。观察组2：从第15天开始接受腹腔注射hIL-10剂量为5 μg/kg[7]。观察组3：从第15天开始接受腹腔注射剂量为5 μg/kg hIL-10联合200 mg威灵仙总皂苷灌胃治疗。

1.2各项指标检测方法

1.2.1大鼠关节影像学评分方法 各组大鼠在实验开始当天，第15天和第35天分别接受左前足X线摄片检查，具体方法为：乳腺钼靶机(意大利吉特乳腺高频X线摄像仪)25 kV，1.0 s，4 mA。骨侵蚀评分如下，0分：正常骨质；1分：仅有1处微小病灶，或疑似存在病灶；2分：存在两个病灶或病灶总和大于50%；3分：存在3个或以上病灶，或病灶面积总和大于等于50%；4分：整个关节面完全破坏或出现骨萎缩。骨关节间隙评分方法如下，0分：关节间隙正常；1分：关节间隙出现异常狭窄，比正常关节间隙变窄25%～50%；2分：关节间隙出现异常狭窄，比正常关节间隙变窄超过50%；3分：关节间隙消失或关节强直[9]。

1.2.2大鼠关节间隙宽度检测方法 各组大鼠在实验开始当天，第15天和第35天按1.2.1条件分别接受左前足X线检查后直接测量大鼠关节间隙。在摄片后，取得大鼠关节片，然后使用分规测量大鼠右后膝关节中心处关节间隙。每次关节间隙测量必须由3位不同实验者重复进行。

1.2.3大鼠外周血淋巴细胞检测方法 各组大鼠被处死后，立即取大鼠外周血200 μL，分为两管，每管100 μL。第一管加入EDTA抗凝，然后加入抗大鼠FITC-CD4抗体10 μL，PE-CD8抗体10 μL，震荡避光静置30 min，加入溶血素2 mL，10 min后离心，弃上清液，加入PBS洗涤1次，最后加入多聚甲醛10滴重悬，流式细胞分析仪检测CD4+T细胞，CD8+T细胞，最后比较CD4+/CD8+水平。

1.2.4大鼠外周炎症因子检测方法 各组大鼠被处死后，立即取大鼠外周血100 μL，3 000 r/min下离心10 min，小心分离血清，按ELISA试剂盒(新博生物科技公司)使用说明分别检测IL-17A、IL-6、TNF-α。反应终止后用酶标仪检测吸光度，根据标准曲线计算外周血中IL-17A、IL-6和TNF-α浓度。

2 结 果

2.1各组大鼠关节影像学评分 实验进行35 d以后，3个观察组骨侵蚀、关节侵蚀评分均低于对照组(P<0.05)。观察组3骨侵蚀、关节侵蚀评分低于观察组2和观察组1(P<0.05)，见表1。

2.2各组大鼠关节间隙宽度情况 实验进行第35天，3组观察组大鼠关节间隙均宽于对照组。观察组3大鼠关节间隙大于观察组1和观察组2(P<0.05)。观察组1大鼠关节间隙大于观察组2(P<0.05)，见表2。

表1 各组大鼠关节影像学评分分)

a:P<0.05，与空白组比较；b:P<0.05，与对照组比较；c:P<0.05，与观察组1比较；d:P<0.05，与观察组2比较

表2 各组大鼠关节间隙宽度变化

a:P<0.05，与空白组比较；b:P<0.05，与对照组比较；c:P<0.05，与观察组1比较；d:P<0.05，与观察组2比较

2.3各组大鼠外周血淋巴细胞情况 观察组3 CD4+T细胞和CD4+/CD8+显著低于对照组、观察组1、观察组2。3个观察组CD8+T细胞显著高于对照组和空白组，见表3。

表3 各组大鼠外周血淋巴细胞变化情况

a:P<0.05，与空白组比较；b:P<0.05，与对照组比较；c:P<0.05，与观察组1比较；d:P<0.05，与观察组2比较

2.4各组大鼠外周血炎症因子情况 空白组IL-17A、IL-6、TNF-α低于对照组和3个观察组(P<0.05)。3个观察组IL-17A、IL-6、TNF-α均低于对照组(P<0.05)。上述指标观察组3低于观察组1(P<0.05)，观察组1低于观察组2(P<0.05)，见图1。

a:P<0.05，与空白组比较；b:P<0.05，与对照组比较；c:P<0.05，与观察组1比较；d:P<0.05，与观察组2比较

图1各组大鼠干预后外周血炎症因子水平情况

3 讨 论

类风湿性关节炎主要病理学特点为滑膜的慢性炎症和血管增生[10]。在疾病发生、发展的过程中，除了骨关节损伤外，伴随着较为严重的免疫失调[11-12]。

AA大鼠是一种常见的用以模拟人类风湿性关节炎的动物模型，本研究以AA大鼠为研究对象，探讨重组hIL-10联合威灵仙总皂苷对患者骨关节的保护作用，和免疫细胞比例及炎症因子紊乱的改善作用。

本研究发现，重组hIL-10联合威灵仙总皂苷可以有效降低AA大鼠骨侵蚀评分和关节侵蚀评分。并且这种作用明显优于单用重组hIL-10和威灵仙总皂苷。这说明这两种药物在治疗类风湿性关节炎的时候存在着协同效应。为了进一步观察治疗方案对关节的保护作用本研究还测量了大鼠关节间隙，发现重组hIL-10联合威灵仙总皂苷也可以有效保护大鼠关节，防止大鼠关节强直维持正常的关节间隙。

本研究还检测了各组大鼠的外周血炎症因子和外周血淋巴细胞比例，随着疾病进展，AA大鼠外周血IL-17A、IL-6、TNF-α会显著升高，但是在使用了不同治疗方案后上述3种炎症因子均得到了不同程度的回落，尤其是使用重组hIL-10联合威灵仙总皂苷治疗的大鼠上述炎症因子回落尤其明显。这说明重组hIL-10联合威灵仙总皂苷可以有效地降低上述3种炎症因子。有研究提示TNF-α抑制剂的使用可以有效地降低类风湿性关节炎患者的关节炎症情况，降低外周血类风湿因子的功能，延缓关节影像学进展[13]。也有文献支持IL-10可以有效降低可溶性TNF受体和TNF-α[14]。IL-6是与RA存在很多关联的多效细胞因子，可以介导JAK/STAT3通路导致类风湿性关节炎的发生[15]。IL-17A是由Th17细胞分泌的一种促炎细胞因子可以促进滑膜炎症[16]。重组hIL-10联合威灵仙总皂苷可以降低上述3种炎症因子，其改善AA大鼠关节影像学表现的重要机制之一。

本研究也发现AA大鼠相对于正常大鼠CD4+T细胞显著升高而CD8+T细胞数量未发生明显改变，因此CD4+/CD8+也显著升高。而经过治疗的AA大鼠CD4+T细胞显著下降，CD8+T细胞显著升高，因此CD4+/CD8+也显著降低。接受重组hIL-10联合威灵仙总皂苷治疗的AA大鼠CD4+T细胞和CD4+/CD8+降低尤其明显。CD4+T细胞可以有效刺激B细胞，导致自身抗体产生增加，从而导致抗原抗体复合物更多地沉积于滑膜，导致滑膜炎症，而CD4+/CD8+也可以提示体内免疫状态，所以重组hIL-10联合威灵仙总皂苷可以有效地调理患者免疫状态[17-18]。

综上所述，重组hIL-10联合威灵仙总皂苷可以通过降低AA大鼠外周血促炎的炎症因子，降低CD4+T细胞调理AA大鼠免疫状态，从而改善AA大鼠关节影像学表现，可以进一步进行临床试验。