转染正常c-CBL基因后耐药GIST体外药物敏感实验研究*

杨 平，陈 博，贾贵清，伍晓汀，张祥运，李 卫

(1.四川省医学科学院/四川省人民医院城东病区胃肠外科，成都 610110；2.安徽医科大学第一附属医院胃肠外科，合肥 246400；3.四川省医学科学院/四川省人民医院胃肠外科，成都 610072；4.四川大学华西临床医学院/华西医院胃肠外科，成都 610041)

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)起源于胃肠道卡哈尔间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)，是胃肠道最常见的间充质源性肿瘤，每年发病率为10～20/100万人[1-3]。虽然GIST的甲磺酸伊马替尼分子靶向治疗效果较好，但仍然有10%～20%GIST的患者会出现原发耐药及40%～50%发生继发耐药[4]，且治疗期间继发耐药每年递增10%,但GIST的耐药机制不明。近年来在急性骨髓性白血病研究发现c-CBL是一种新型泛素连接酶E3，可以负调节受体酪氨酸激酶(RTK)；突变的c-CBL能够激活其他RTK(如c-Kit)[5-6]。这些成果对探索有效逆转甲磺酸伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤有较重要的参考意义。因此，本研究将正常c-CBL基因导入GIST耐药细胞，观察在体外甲磺酸伊马替尼对耐药细胞生长影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料 瘤源细胞来自1例29岁青年男性患者，诊断为小肠间质瘤复发伴腹腔转移。腹腔瘤体出现体积增大，有再次手术指征。

1.1.2主要试剂 中性蛋白酶(Dispase)购于美国GIBCO公司，胎牛血清(FBS)购于美国GBICO公司，RPMI-1640培养液购于杭州吉诺生物医药公司，C-kit抗体购于美国Snata Curzt公司，c-CBL抗体购于美国BD公司，甲磺酸伊马替尼(格列卫，Glivec) 购于瑞士Novatis公司，携带正常c-CbL基因的反转录病毒载体购于中国大连宝生物工程有限公司。

1.1.3主要仪器 CO2培养箱(德国Heareus公司)，倒置显微镜(日本Olmypus公司)，超净工作台(德国Hearues公司)，低温高速离心机(德国Heraeus公司)，四唑盐比色法(MTT)酶标仪(美国Bio-TEK)。

1.2方法

1.2.1GIST原代细胞的获取、分离和培养 选择经手术切除后腹腔内复发的GIST患者(口服甲磺酸伊马替尼)超过6个月(400 mg/d),影像学证实腹腔瘤体复发)，有手术指征。手术切除的新鲜GIST组织经快速病理证实为梭型细胞肿瘤，将肿瘤剔除坏死及污染组织，PBS冲洗3次，再用含500 μg/mL庆大霉素、500 μg/mL链霉素、500 μg/mL青霉素的无血清RPMI 1640冲洗，剪碎组织，加入2倍体积的1 mg/mL中性蛋白酶，37 ℃消化60 min，收集单个及小块组织的瘤细胞，离心洗涤2次，收集单个及小块组织的瘤细胞接种于150 mL培养瓶中，培养条件为含20%FCS的RPMI-1640/DMEM。次日弃上清液，换新鲜培养液，此后每隔3 d换液1次。

1.2.2培养细胞生物学特性的鉴定 细胞形态学观察：倒置显微镜形态学观察：取对数生长期细胞在培养瓶中进行培养，待细胞长满瓶底约80%时观察细胞，并在倒置显微镜下拍照；细胞爬片免疫组织化学：(1)将专用爬片泡酸，三蒸水冲洗及高压消毒后放入干燥箱备用；(2)胰酶消化后制成细胞悬液并计数，调整细胞密度105/mL，将细胞接种于含玻片的培养皿中，置入CO2培养箱中培养；(3)待细胞爬满玻片后取出玻片，用PBS冲洗2次；(4)将爬片用95%的乙醇固定15 min后用PBS冲洗2次；(5)PBS清洗标本3次各1 min；(6)冰丙酮固定 15 min(或4%多聚甲醛固定30min)；(7)空气干燥5min后PBS清洗标本3次 各 2 min；(8)0.5%Triton X-100(DPBS配)孵育1次20 min；(9)PBS清洗标本3次各2 min，再3%H2O2(试剂A)孵育15 min；(10)DPBS清洗标本3次各2 min；(11)封闭血清孵育(试剂B)20 min；(12)一抗孵育(滴度1∶200，湿盒)4 ℃ 过夜或37 ℃ 60 min，阴性对照用一抗来源血清；(13)PBS清洗标本3次各5 min；(14)二抗工作液孵育(湿盒试剂C) 37 ℃ 30 min；(15)PBS清洗标本3次各5 min；(16)试剂D(湿盒) 37 ℃ 30 min；(17)PBS清洗标本3次，各5 min；(18)DAB显色(避光，镜下观察至棕色 ) 3～10 min；(19)蒸馏水洗2次1 min；(20)苏木素复染0.5～1.0 min；(21)自来水洗返蓝；(22)梯度乙醇脱水75、85、95，100%各需3 min；(23)二甲苯透明2次各3 min；(24)中性树胶封片。RT-PCR检测细胞系c-Kit基因的突变位点状况如下，上游引物：5-CTG GGT CAC TTT GAT ATG GT-3,下游引物：5-AGC CCT GAC CTT CTG ATT C-3。据PCR反应试剂盒说明书，反应体系：模版c-DNA 5 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，Sterile water 18 μL，混匀后加入High Fidelity PCR Master 25 μL，混匀。总反应总体积为50 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；循环结束后，72 ℃延伸7 min。PCR扩增在PE2400型PCR仪上进行。琼脂电泳证明扩增成功后。选择PCR base line substrated 模式进行数据分析和修正。以第4至15个循环荧光强度值标准差的10倍作为荧光阈值，确定不同处理间的CT值，进行分析。

1.2.3反转录病毒的转染 携带有正常c-CBL基因反转录病毒转染：将第3代耐药GIST细胞，培养24 h后，将逆转录病毒按1∶10病毒滴度，加入到培养瓶中，继续培养72 h，在荧光显微镜下进行观察。

1.2.4GIST细胞体外药物敏感性测定(MTT法) 常规用胰酶消化GIST细胞，离心后弃上清液，用培养基重悬细胞后，接种培养。24 h后，加入不同浓度的药物，每个浓度设3个复孔并设对照孔。分别培养48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT，4 h后每孔加入二甲基亚砜，振荡使结晶物混匀，在酶标仪570 nm波长处读取光密度(A)值。重复3次。存活率(%)=(实验组A值/对照组A值)×100%，抑制率(%)=(1-存活率)×100%。

2 结 果

2.1耐甲磺酸伊马替尼细胞来源患者 患者男性，29岁，小肠间质瘤复发伴腹腔转移。术后免疫组织化学：CD117(+)，CD34(+)，S-100(-)，SMA(-)，Desmin(-)，支持小肠间质瘤伴腹腔内转移。

2.2耐药GIST原代细胞生长的培养条件 在细胞分离方法上，使用1 mg/mL中性蛋白酶消化培养方法最容易分离出细胞，最适合耐药GIST原代细胞生长的培养基是含20%进口的GBICO公司的CFS的RPMI-1640。

2.3原代耐药GIST细胞的形态及生长情况 刚分离的耐药原代细胞大约10 h开始贴壁，48 h伸展开，72 h完全伸展开。原代培养的细胞第5天起开始增殖，第10天可传代。耐药GSIT原代细胞在倒置显微镜下呈互不重叠的单层，细胞生长呈成纤维细胞状，为长梭型(图1)。传代1～2代后细胞生长加快，3～4 d传代1次。传代7～10代后耐药原代细胞生长变慢，细胞倍增时间延长，细胞皱缩，后出现衰老、死亡。

图1 原代耐药GIST形态学(×200)

图2 细胞爬片后免疫组织化学示CD117+(×200)

2.4原代耐药GIST细胞生物学鉴定 细胞爬片后免疫组织化学染色鉴定(CD117+)，即胞质、胞膜中出现棕黄色反应产物(图2)，为典型GIST表现。Western Blot 检测耐药GIST的c-kit表达：Western Blot 检测耐药GIST的c-Kit稳定表达c-Kit蛋白，该细胞具有典型GIST细胞特征(图3)。RT-PCR产物测序结果显示耐药GIST细胞C-kit突变位点位于第9号外显子，是编码丙氨酸和酪氨酸的(502Ala-503Tyr)的6个核苷酸的串联重复插入，导致了GIST发生，RT-PCR检测c-Kit基因突变位点见图4。

图3 耐药GIST细胞表达c-kit表达情况

图4 耐药GIST细胞KIT基因突变位点

2.5耐药GIST细胞转染 从荧光显微镜观察结果显示，1∶10的病毒原液滴度转染耐药GIST细胞获得95%的转染效率(图5)。

图5 荧光显微镜结果(×100)

2.6转染前后耐药GIST对不同浓度的甲磺酸伊马替尼作用 转染前耐药细胞在1.60 μmol/L浓度时，抑制率未超过50%；但转然后，在0.10 μmol/L浓度抑制率达到(76.50±1.71)%，继续增加浓度，抑制率未发现明显升高。转染前后不同浓度的抑制率差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 不同浓度甲磺酸伊马替尼对转染前后耐药GIST作用72 h的抑制率%)

3 讨 论

目前国内少见成熟的耐药GIST细胞株出售，国外已经建立的GIST细胞株有GIST780、GIST-T1、GIST48、GIST882,、GIST430[7-9]。GIST882是经典的敏感细胞，对甲磺酸伊马替尼高度敏感，但是体外不易培养[10]。本研究结果显示，经原代培养后，耐药GIST 细胞在倒置相差显微镜下呈团块样生长，可见核分裂象，细胞核型为多倍体。在细胞分离方法上，本研究发现使用1 mg/mL中性蛋白酶消化培养的方法最容易分离出细胞，GIST细胞也最容易爬出。1%胰酶消化法分离的细胞数少，细胞存活率低。而组织块培养法细胞很难爬出。最适合耐药GSIT原代细胞生长的培养基是含20%进口的GBICO公司的CFS的RPMI-1640。 同时耐药GIST细胞在传代7～10代后细胞生长变慢，细胞倍增时间延长，细胞皱缩，后出现衰老、死亡。所选标本术后组织DNA 测序均提示C-kit 基因第9 外显子病理性突变，培养耐药细胞爬片，Western Blot检测显示为所培养耐药细胞CD117+，耐药细胞稳定表达C-kit蛋白，因此表明经培养后原代耐药GIST保留了人GIST耐药细胞的生物特性。

本研究甲磺酸伊马替尼对GIST细胞作用72 h的MTT实验结果显示：转染前耐药细胞在1.60 μmol/L浓度时，抑制率未超过50%；然而转然后，在0.10 μmol/L浓度抑制率达到76.5%，继续增加浓度，抑制率未发现明显升高。提示转然正常c-CBL后的细胞对甲磺酸伊马替尼敏感。本研究证实了在耐药GIST中转染了正常c-CBL基因后，提高了对甲磺酸伊马替尼的敏感性，这说明正常的c-CBL在间质瘤中可能起着抑癌基因的作用。c-CBL这种作用与RATHINAM等[6]在慢性髓样细胞白血病类似。

但是c-CBL基因是如何参与调控GIST细胞增殖、分化，其机制目前不清楚。在白血病细胞研究中发现c-CBL能和PI3K的p85亚基的相互作用，促使PI3K泛素化并经蛋白酶体降解[11-12]，提示其能负调控PI3K/Akt信号通路。有研究提示c-CBL通过泛素结合酶与受体酪氨酸磷酸化的蛋白质结合，导致其泛素化及降解，而负调控表皮生长因子受体，影响其蛋白表达水平[13]。本研究是初次从宏观探索c-CBL其在耐药GIST的作用，转染正常c-CBL后的耐药细胞对甲磺酸伊马替尼敏感性有所提升，但其机制不清楚，有待下一步研究继续深入。