DNA快速检验在法庭科学中的研究进展

李 甫，王颖希，焦章平,*

(1.北京市东城区公安司法鉴定中心，北京 100061；2.北京市公安司法鉴定中心，北京 100192)

DNA鉴定在刑事侦查中能够起到认定嫌疑人、提供侦破线索、串并案件、排除犯罪嫌疑、为法庭提供证据等作用。DNA鉴定技术自1985年被应用于法庭科学以来，历经DNA长度多态性和DNA序列多态性检验，如可变数目串联重复（VNTR、也称DNA指纹）、短串联重复序列（STR）、线粒体DNA（mtDNA）、单核苷酸多态性（SNP）等主要技术，广泛应用于法医物证领域的个体识别与亲缘鉴定。随着其个体识别鉴定能力的不断提高，检验速度也渐趋加快，而由以前的6～8周缩短为数小时。目前，常规DNA检验包括DNA提取、DNA定量、PCR扩增及电泳分离检测等多个步骤，整个过程大约需要8～10 h。但刑事案件对更快侦破速度的追求是无止境的。本文试探索分析DNA鉴定如何跟随技术发展进步实现快速检验。

1 DNA快速提取

DNA提取是DNA检验的第一步，目的是将证据材料或细胞中的DNA分子释放出来，并与蛋白质、核酸酶等其他细胞成分或干扰物分离，从而可将DNA制备成后续检验所需要的形态。

1.1 血斑、唾液斑、脱落细胞类检材

法医DNA原先使用有机提取法和Chelex-100法[1]，但随着检材类型的丰富和数量的激增，这两种方法已不能满足高通量自动化工作站的要求。目前，提取DNA主要使用磁珠法，利用全自动核酸提取纯化仪可实现常规检材DNA的高通量提取，所需时间约 2～4 h。

2003年，Moss等[2]报道了利用来自南极芽孢杆菌EA1的中性蛋白酶提取DNA的方法。该酶在二价阳离子环境中稳定，可在75 ℃下裂解细胞而释放出DNA并同时降解核酸酶等蛋白质。整个提取过程在一个封闭环境中进行，无需样本转移，从而降低了交叉污染的可能性和微量模板的损耗。2013年，ZyGEM[3]公司（新西兰）利用该原理研究开发了PDQeX2400高速核酸提取仪，该仪器通量为24道，可以在7～20 min内对血斑、唾液斑、精斑、脱落细胞等常规检材进行提取与纯化。较目前常规DNA提取方法缩短了至少75%的时间。2016年，国内博坤公司应用纳米二氧化硅磁性复合微粒研发的磁珠提取试剂盒，以交联技术将二氧化硅磁性纳米粒子制备成微米尺寸的交联体，所得二氧化硅磁性复合微粒表面具有纳米级突起，能够更大表面积地捕获DNA，提高DNA的提取量，其处理96个样本仅需60 min。

1.2 精斑

在性侵案件中，常为男女混合检材，常规提取选用差异裂解法。第一步先消化女性阴道上皮细胞DNA，再消化男性精子细胞的DNA，而后进行精子细胞DNA的常规提取，需耗时将近一天。差异裂解法成本低，是处理精液阴道混合液（斑）的主要方法，但是成功率很大程度上受检验人员经验水平等主观因素和检材条件等客观因素的影响。近年来，针对性侵案件中男女混合检材，美国Promega公司研发了商品化试剂盒Differex™ System，利用蛋白酶K结合相差分离及差速离心技术对混合斑中的精子和上皮细胞进行分离提取，操作简易，分离纯化仅需2 h[4-5]；也有人使用DNaseI结合碱性裂解法提取混合斑中的精子DNA[6]，整个过程只需一个离心管，避免了精子DNA损失，提高了成功率，且可在2 h内操作完成[7]。Norris等[8]研发一种基于超声差异提取的微流体装置，首先清除混合斑中的上皮细胞，然后利用超声能在14 min内完成精子细胞与其他成分的分离。

微流控技术对于法医物证检验中常遇到的混合、微量等疑难检材处理具有优势，可根据细胞间物理、化学性质的差异，通过流体、电场、超声等方式主动富集样本。欧元等[9]使用基于重力驱动的微流控芯片，在玻璃-PDMS芯片上对混合样本进行分离，可在30 min内分离出精子，且不会有上皮细胞进入分离通道。美国Micro fluidic Systems公司研发的微流控芯片通过先用低能量超声波选择性裂解上皮细胞，再以高能量超声波裂解精子细胞，因此达到自动化差异裂解，可在3 h内分别得到男性、女性的DNA[10]。

1.3 骨骼、牙齿类检材

已报道的提取方法有Chelex-100法、有机提取法、CTAB 法、硅珠法等。上述方法需要脱钙、孵育、有机纯化等步骤，用时较长，同时繁琐的步骤也加剧了DNA的流失。苑美青等[11]报道使用压力循环仪提取骨骼DNA，比实验室常规方法缩短了24 h以上，提取效率提高6%～49%。压力循环仪基于流体静力学原理，通过改变样本周围压力，打破分子间相互作用，同时也有效减少了PCR抑制因素[12]。高林林等[13]使用AutoMate Express™（美国 Applied Biosystems公司）自动化工作站进行骨骼、牙齿的DNA提取，成功率较高（骨骼93.9%、牙齿93.3%），其法具有取材量少（仅为手工提取样本的1/10～1/8）、提取时间短（56 ℃消化2 h及自动化提取30 min）、易于实现高通量（同时进行13份检材的提取）和自动化操作等优势。

2 DNA免提取

目前的商品化PCR试剂盒均具有较高的灵敏度及较强的抗抑制能力，对于大多数检材可以免去提取过程，进行直接扩增。近年相继有进口、国产商品化免提取的试剂盒研发上市。免提取试剂盒在PCR反应液中添加了PCR反应抗抑制物质[14]，对于血红素、鞣酸、腐殖酸等抑制物的耐受性很高。直接扩增法的优势如下：1) 加快了检测速度。省略了提取、纯化等复杂步骤，节约了时间也有效地防止了提取过程的污染。2) 节约成本。无需提取、纯化等步骤所需的相关耗材试剂。3) 检材用量少。血卡、唾液卡及烟蒂仅需剪取1 mm×1 mm的小片，即可获得满意的结果。有文献报道，直接扩增法适用于多种检材[15-16]，如血斑[17-18]、唾液斑[19]、脱落细胞[20]、毛发[21]、肋软骨[22]等，均可根据检材条件尝试应用直接扩增法。

直接扩增法在DNA数据库建设[23]、DVI及群体性突发事件中，能够显著提高DNA检验的速度。但是，直接扩增法也有一定的局限性，不适用于模板量大以及微量、抑制物多的检材。使用直接扩增法时，电泳前要对扩增产物进行离心，将直扩样本沉入管底，或者将检材载体挑出，切不可吸入载体，以防止堵塞电泳仪的毛细管。另外，DNA免提取也会缩短毛细管的使用寿命。

3 快速扩增

试剂盒（德国QIAGEN公司）将AmpFlSTR®Sinoif ler™试剂盒（美国Applied Biosystems公司）扩增时间缩短至60 min以内；2013年，刘琳等[26]通过比较4种快速PCR检测试剂与AmpFlSTR®Identifiler®（美国Applied Biosystems公司）相结合，总结出分型结果清晰准确、扩增用时仅22min的快速PCR检测方法；随后他们将所建立的体系应用于血卡的直接扩增，得到了与常规提取、扩增结果一致的STR分型[27]。2017年，Han等[28]报道了包含14个STR基因座和1个性别基因组的快速PCR反应体系，PCR反应只需37 min。

快速PCR主要从三个方面进行改进：聚合酶和添加剂的优化、程序的完善以及热循环仪的革新[24]。SpeedSTAR™ HS DNA Polymerase（日本TaKaRa公司）、PyroStart™ Fast PCR Master Mix（立陶宛 Fermentas公司）、Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix（美国Thermo Scientific公司）等产品都包含可加快PCR反应的快速酶[29]。快速PCR仪的技术核心在于能提高PCR仪的升降温速率并同时保持样品与金属槽温度的一致性，从而达到缩短变性、退火、延伸等驻留时间的目的，常用的快速PCR仪有 C1000 Touch™PCR仪（ 美 国 Bio-Rad公 司 ）、Mastercycler®PCR 仪（德国 Eppendorf公司）、Piko™PCR仪（芬兰Finnzymes公司）及SpeedCycler2PCR仪（德国analytikjena公司）。李甫等[30]报道使用SpeedCycler2 PCR仪可以在保证实验结果准确的前提下，有效缩短扩增时间，以Identifiler®Plus试剂盒为例，扩增时间可从2 h 40 min缩短至1 h 20 min。快

PCR扩增是获得准确STR分型的关键步骤，同时也是DNA检验最耗时的环节。2012年，Laurin等[24]使用日本TaKaRa公司的快速PCR扩增试剂对 AmpFlSTR®Profiler Plus®试剂盒（美国 Applied Biosystems公司）进行优化，将扩增时间缩短至26 min；同年，王洪迪等[25]应用Fast Cycling PCR Kit速检验方法是近几年随着新产品及技术的发展而出现的，目前市面上有较多的商品化扩增试剂盒，其扩增时间大大缩短。

4 快速电泳

法医物证实验室多数使用美国Applied Biosystems公司的遗传分析仪，以使用Identifiler®Plus试剂盒为例，3130xL遗传分析仪可以在45 min完成16个样本的检测，而3500xL遗传分析仪35 min就可以完成24个样本的检测，对于整板96个样本检测来说时间可从4 h 30 min缩减至2 h 20 min。

平原等[31]自主研发了一种新型毛细管电泳凝胶EX-Q20，原理是在N,N-二甲基丙烯酰胺存在的溶液中合成丙烯酰胺-N,N二甲丙基烯酰胺，形成一种新型的准互穿聚合物网络，以此解决传统毛细管电泳凝胶不能兼顾分离效果与自涂敷功能的难题。在3130xL遗传分析仪上电泳一组样本，EX-Q20胶用时 20 min，POP4胶 用 时 45 min。Connon等[32]在3130xL遗传分析仪上用 POP6胶和22 cm毛细管替换POP4胶和36 cm毛细管，可以将电泳时间从45 min 减少至 24～28 min。

5 快速检测仪

当前法医学DNA鉴定从提取到出结果需要在实验室内分步完成，每步前期处理都需要人工干预。如果可以做到“样本进-结果出”，就可在解放人力的同时也降低检材在每一步骤中间转移时可能存在的污染风险。微流控芯片技术（micro fluidics）又称微型全分析系统（μTAS）或芯片实验室（lab on a chip），是指通过微纳米加工，在一块玻璃或塑料芯片上集成微管道、微泵、微电极等控制和传感单元[33-35]，检材对象包括核酸、蛋白、细胞、爆炸残留物、毒物等[36]。该技术可以减少人工干预，实现集成化、自动化和微型化。法医物证中所涉及的微流控芯片包括细胞分离芯片、DNA提取芯片、PCR扩增芯片、毛细管电泳芯片等功能模块和多功能整合的芯片系统[37-38]，如PCR-毛细管电泳(CE)芯片、DNA提取-扩增-电泳一体化芯片。

2008年，Liu等[39]研制了PCR-CE芯片，将DNA检验设备放置于工作车上，现场提取血迹随即在车上进行检验，将STR分型结果传回实验室进行比对，再将比对结果传回现场，整个流程可在6 h以内完成。后该实验室于2011年又研发了二代PCRCE微流控系统[40]，可同时检测12份样品的9个STR基因座，灵敏度达17～18个二倍体细胞DNA。2014年，Roux等[41]构建了用于法医STR快速分析的PCR-CE芯片，该系统采用一次性塑料芯片，以非接触式红外加热方式45 min完成扩增，能在7 cm的电泳芯片上15 min完成18个基因座的分离。目前已有商品化的全自动基因分析仪面世。2013年美国IntegenX公司推出RapidHIT®200DNA快速检测仪，结合PowerPlex®16HS试剂盒（美国Promega公司）可在90 min内同时完成5～7份血斑、唾液斑等生物检材的DNA检验，分型结果可以导入数据库进行比对[42-46]。同年，GE公司（美国）与Network Biosystems公司（美国）合作推出了DNAScan快速DNA分析仪，可以在85 min内完成5份生物样本的16个基因座的DNA检验[47]。2014年，LGC公司（英国）研发的ParaDNA®Screening系统通过样本收集器可同时进行4份样本的制备，采用screening模块对2个STR基因座和性别基因座进行PCR扩增，通过探测探针的荧光强度变化检测DNA值，从而判断STR分型的可能性，整个过程需要75 min。Ball等比较了ParaDNA®Screening系统和传统STR试剂盒对381份样本的分型一致性，可达98.4%，表明该系统可以辅助法医DNA检验人员进行现场检测。

表1 常见商品化快速检测仪的比较Table 1 Comparison of DNA rapid detectors

6 总结

当前，DNA鉴定技术在打击犯罪、惩治罪犯中发挥着越来越重要的作用。刑侦工作中，一般认为距离案发时间越近锁定嫌疑人，案件侦破的成功率就越高，反之则越低。随着民众法律意识的增强和“重证据、轻口供”的刑诉法法治思维方式的实践，如何在有限的羁押期限内获得关键有力的证据证实犯罪，对DNA鉴定技术的时效性提出了更高要求。当前“以审判为中心的诉讼制度改革”中证据裁判的法治原则对DNA鉴定技术的准确性和可靠性也提出了更高的要求。如何快速而同时保证检验结果的准确与可靠，是未来新技术和新设备亟待解决的关键问题。一种新技术、新方法的出现，往往需要大量、反复的实验验证才能应用于实际案件的检验中。上述所有可缩短DNA检验时间的方法均是相关从业人员所关注的热点，许多方法仍有不足之处，需要业内人员共同研究攻克，但缩短DNA检验时间不能以减少通量及加长检验人员样本预处理时间为代价。可以预见，越来越多的DNA快速检验设备必然会大量涌现，将朝着高通量、集成化、轻量化、操作简便的方向发展，这将会使非专业技术人员也能在现场、短时间内完成全部DNA的检验。