英国史宾格犬感染H3N2亚型犬流感病毒后的病理损伤

秦海斌 贺星亮 宋珍华 温 海 朱 骞

流感是流行性感冒（Influenza）的简称，是由流感病毒引起的以呼吸系统症状为主的急性传染病，犬流感作为一种新型流感类型是由犬流感病毒（Canine infl uenza virus，CIV）引起的以精神沉郁、体温升高、咳嗽、流鼻涕、呼吸困难为主要临床特征的疾病。流感病毒根据其核蛋白（Nucleoprotein，NP）和膜蛋白（Matrix proteins，M1）的特性不同，可分为甲、乙、丙三型，甲型流感依据HA和NA抗原的血清学特征分为135种HN亚型。

流感病毒的重要流行病学特征是种间传播，目前报道的马源犬 H3N8、禽源H5N1 亚型CIV、禽源 H3N2流感病毒均可跨越种间传播，但鉴于H3N8、H3N2亚型已经在犬群中水平传播并形成了稳定的谱系，因此狭义上的犬流感病毒特指这两个亚型，其中H3N8主要在北美洲流行，H3N2主要在东南亚、韩国及中国流行，国内对犬流感病毒的研究多以H3N2亚型为主导。有研究证实，在世界范围内已经有多个其他亚型的甲型流感病毒在犬之间实现了自然传播，包括禽源H5N2、H9N2、H3N2重组的H3N1亚型、季节性H3N2人流感和2009年甲型人流感亚型等。犬已经成为流感病毒的易感动物。

犬流感症状与支气管博氏杆菌或犬副流感病毒引起的窝咳相似，不同的是，严重犬流感可引起高烧，温度可达39.5℃～41.5℃，个别出现肺炎，严重时会引起死亡。该病在警犬技术实践中发现，犬流感发病率高，但症状轻微，潜伏期为2～5天，咳嗽一般持续 3 周左右，初期表现为柔性湿咳，个别也可能出现干性咳嗽，运动和应激可引发剧烈咳嗽，该病死亡率不高，死亡犬多死于自身免疫功能低下导致的继发肺部感染。

但有一个重要的不可忽视的问题是：嗅觉是警犬嗅探作业的基础，是影响警犬实战能力的关键因素，犬流感病毒对工作犬上呼吸道的感染伴随着嗅觉通路的损伤。在人的相关研究中，上呼吸道感染后的嗅觉损伤以器质性损伤为主，少数伴有神经系统的损伤，是嗅觉功能障碍的首要的因素，由其导致的嗅觉障碍占嗅觉障碍人群的18%～36%，嗅觉损伤部分表现为炎症反应，鼻黏膜肿胀，分泌物增多，到达嗅区的空气减少，导致嗅觉减退；另一部分表现为嗅上皮反复损伤，嗅黏膜遭到严重破坏，逐渐被呼吸上皮取代或发生鳞状上皮化生，嗅觉感受细胞发生不可逆改变，从而丧失嗅觉功能。嗅觉功能障碍患者中有40%的嗅觉不能恢复。目前警犬嗅觉损伤尚缺乏相关的研究数据，但结合近年来不断上升的上呼吸道感染疾病，推测嗅觉功能减退和嗅觉功能丧失在警犬中占有一定比例。

对此笔者在2016～2018年的中国警犬犬流感流行病学调查的研究中，对主要流行于东南亚及我国的H3N2亚型犬流感病毒进行了血清学调查，发现我国警犬的总体感染率约为6%。为了进一步验证上呼吸道感染后警犬的病理变化，尤其是嗅觉通路相关组织器官的损伤，笔者以英国史宾格犬作为实验用动物，建立了H3N2亚型流感病毒人工感染模型，对感染模型的病理变化及嗅觉通路的损伤进行了研究，发现感染后史宾格犬的上呼吸道、消化道等多个系统的组织器官出现了炎症变化，在我们重点关注的嗅觉通路相关组织器官中嗅觉黏膜上皮出现了炎症变化，嗅觉神经器官未见病理损伤，提示嗅觉功能的损伤主要发生在上呼吸道黏膜上皮中。

一、研究方法

CIV地方毒株A/canine/Nanjing/11/2012(H3N2)毒株经鸡胚传代后，取1mL HA效价为28的病毒经鼻腔、口咽部感染健康史宾格犬，麻醉后采集体内各个组织器官，包括鼻甲、喉头、气管、支气管、细支气管、肺脏等呼吸系统组织；食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠、直肠消化系统组织；心、肝、脾、肾、胰脏、胸腺、扁桃体、肠系膜淋巴结、大脑、小脑、嗅球、睾丸、骨骼肌等其他组织器官。器官采集后以10%的多聚甲醛固定，4℃保存备用。按照常规方法操作石蜡包埋、组织切片、脱蜡水化、抗原修复，切片厚度为4～7um，然后进行HE染色：切片脱蜡水化后，苏木素染液染色5～20min（根据不同组织和实验要求调整），自来水冲洗，分化液分化30s，自来水浸泡15min或温水（约50度）5min，置伊红染液2min（根据不同组织和实验要求调整），自来水冲洗，自来水浸泡5min，梯度酒精脱水： 95%、100%I、100%II各1min，二甲苯透明：二甲苯I、II各10min，中性树胶封片，放入60度烘箱中烤干，显微镜下观察。

二、研究结果

人工感染H3N2亚型犬流感病毒后，史宾格犬不同组织器官的HE染色图片，见下图：

对图中不同器官的病理学变化进行概略描述，见下表。

轻微炎症，轻微炎性细胞浸润会咽软骨 未见异常咽未见异常食道 未见异常胰腺 未见异常肝轻微炎症，轻微炎性细胞浸润胃轻微炎症十二指肠 轻微炎症，轻微炎性细胞浸润空肠 轻微炎症回肠 轻微炎症结肠 轻微炎症盲肠 轻微炎症扁桃体 轻微细胞增生，淋巴滤泡增多，轻微炎症胸腺 未见异常脾 脾窦扩张充血，淋巴细胞增多，中度炎症肠淋巴结 淋巴细胞增多，中度炎症心肌 未见异常样本 H E分析鼻甲 鼻粘膜可见炎症侵润鼻中膈 中度炎症大脑 未见异常小脑 未见异常嗅球 未见异常气管 未见异常支气管 未见异常细支气管 未见异常肺肾肾小球体积增大且细胞增多，部分肾小管上皮细胞坏死脱落和水肿，轻微炎性细胞浸润睾丸 未见异常骨骼肌 未见异常

三、讨论

根据图和表的结果，不难发现在犬流感病毒感染模型中，流感病毒对上呼吸道、消化器官、免疫器官、泌尿生殖器官造成了较大的损伤；在上呼吸道的鼻甲、鼻中膈的黏膜上皮中可见明显的炎性浸润，这与感染模型表现出的流鼻涕、咳嗽等症状相吻合，从嗅觉通路的组成来看，鼻甲骨和鼻中膈的黏膜是重要的嗅细胞分布区域，因此流感病毒的感染对嗅觉通路中嗅细胞的损伤是不可避免的；在嗅觉相关神经组织中，主要包括大脑、小脑。嗅球未见明显的病理学变化，说明病毒对神经器官无病理性损伤。在感染模型中，流感样的症状可持续至病毒感染后2周， 说明对嗅觉黏膜的损伤可持续至感染后2周，但嗅觉上皮的功能恢复、是否发生嗅觉功能障碍等问题，由于目前缺乏有效的嗅觉能力测定手段而无法开展。在今后的研究中，客观、精确的嗅觉能力评价方法是警犬技术领域需要重点研究的方向，这不仅是阻碍工作犬嗅觉相关基础研究的难点问题，也是涉及到嗅觉障碍、遗传育种、日常训练、警犬实战的多个方面的重点问题。

另外，流感病毒的高频率抗原变异，必需引起重视。流感病毒的血凝素（HA）识别的受体分为2类：α-2,3半乳糖苷唾液酸（SA2，3Gal）和α-2,6半乳糖苷（SA2，6Gal）。禽流感病毒和马流感病毒对SA2，3Gal具有亲嗜性，而人流感病毒和猪流感病毒对SA2，6Gal的亲和性最高，由于猪呼吸道上皮细胞同时具有2种类型的流感病毒受体，因此，人流感病毒和禽流感病毒都可以感染猪，猪被认为是禽流感病毒、人流感病毒的基因重配的中间宿主和基因“混合器”。对犬的研究发现，犬的呼吸道上皮细胞也同时表达2种唾液酸受体，加上多种亚型（马源H3N8、禽源H3N2、H5N1、H5N2、H9N2）的流感病毒对犬易感，在理论上犬已经具备了通过基因重组产生新型流感病毒的基本条件，在现实中犬是否会跟猪一样最终成为另一个新的流感病毒基因“混合器”，值得公共卫生领域和警犬技术领域长期关注。