饲料中金霉素含量近红外检测模型的创建

, ,

(浙江大学动物科学学院,浙江杭州 310058)

金霉素作为药物添加剂允许应用于饲料中，具有较好的保障动物健康, 促进动物生长,提高饲料利用率等作用。同样金霉素若长期不规范使用也会诱发耐药菌的产生和引发食品安全问题。目前有些生产者为了追求利益，获得较好的饲喂效果，会以高剂量非法添加，或者在不允许使用的时期或动物品种中使用，因此对饲料中金霉素含量建立一种快速的检测方法，可以有效制止其乱用。目前有较多的方法可以分析饲料中金霉素含量，主要有：微生物学法、薄层色谱法、酶联免疫法、毛细管区域电泳法、高效液相色谱法和液相色谱—质谱法等，但无论哪种方法,都还存在着测定周期长、成本较高、操作复杂的问题。

近红外光谱(NIRS)技术是一种快速绿色分析技术之一，具有分析速度快，对被测样品无损伤和无化学试剂污染等优点，适合于不同饲料配方的检测。本项目所建定标模型中通过内部交互验证和外部验证的方式，对其准确性进行评估验证，以期丰富近红外预测猪饲料化学成分的模型，为该技术在饲料行业推广应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1样品收集与制备 本试验样品共有232个，为不同阶段的各类猪全价配合饲料，来自慈溪市宇欣畜禽养殖场、嘉兴红太阳饲料有限公司、嘉兴敦好农牧有限公司、浙江华腾牧业有限公司。用HPLC-MS鉴定确保饲料中没有添加金霉素，实验室制备成金霉素浓度梯度在0～130 ppm的试样，经高效液相色谱仪测定含量范围在0～135.59 ppm后，备用。

1.2样品光谱的采集 试验仪器为丹麦FOSS公司生产的NIRS Infraxact(TM)近红外光谱仪，美国Waters公司生产E2695高效液相色谱仪，美国Waters公司生产Xevo TQ四极杆串联质谱仪。

采样室物理条件：防尘、防震、工作温度稳定20℃～25℃，工作湿度60%。

近红外光谱仪主要工作参数：光谱采集范围575 cm-1～1850 cm-1扫描次数64次，分辨率8，数据型式，log(1/R)。

每次开机扫描光谱前，仪器预热60 min，以仪器内置参比标准样品做背景校正仪器，扫描三次。如果标准样品测定值基本一致则说明仪器性能良好，可以进行实验，如果标准样品扫描结果相差较大，则从新预热、矫正仪器。为了得到良好的光谱重现性，样品杯中的样品厚度、紧实度、均匀度尽量做到一致。

1.3样品测定

1.3.1样品化学标准值分析 金霉素化学含量分析按照国家标准(GB/T 19684-2005)的高效液相色谱法的测定方法进行。

1.3.2光谱处理和数据分析 将192份样品进行光谱扫描，保存光谱文件。将1.3.1所测数据用计算机输入对应的光谱文件，建立起一组定标文件。采用WinISI III定量分析软件中改良的偏最小二乘回归方法(MPLS)建立化学成分含量的近红外光谱校正模型，并通过内部交叉检验，以最小内部交叉检验均方根误差(RMSECV)为指标，确定最佳主成分维数、光谱区间和光谱预处理方法，建立校正模型。

使用改良偏最小二乘法建立定标模型。为消除光谱信号的基线漂移、随机噪音及颗粒度不均匀引起的散射，光谱采用三种去散射处理和两种导数处理结合，共六种光谱预处理方法。三种散射校正方法包括：无散射(None)，标准正常化+散射处理(SNV and Detrend)，标准多元去散射校正(Standard MSC)。三种数学处理方法包括：0，0，1，1；1，4，4，1；2，4，4，1。四个数值依次代表：导数处理的阶数、做导数处理计算所采用的光谱点间隔、平滑点数和二次平滑点数。模型建立过程中，三种散射处理和三种数学处理相互任意组合，交互验证组合以最小交互验证误差(SECV)和最大交叉验证相关系数1-VR确定最佳模型。

1.3.3异常值判断与剔除 异常值判断与剔除是影响模型预测效果的关键因素，本试验采用判定马氏距离的方法剔除光谱异常值：GH≥3.0和NH≤1.0(GH含义为得分的三维图中，每个样品距离中心样品点的距离。NH为临近马氏距离)。一般GH≤3.0 的样品视为来自同一群体，GH>3.0 的样品则视为异常样品予以剔除。

1.3.4定标模型的检验与评价指标 本实验采用内部交叉验证和外部验证两种方式对定标模型进行检验。外部验证样品不参与建模，是独立验证集。以最高交互验证决定系数(1-VR)和最低交叉验证标准差SECV值确定最佳定标模型。此外，还有衡量模型预测效果的统计参数：定标标准偏差(SEC)、验证标准差(SEP)、定标相关系数(RSQ)、交叉验证相关系数(1-VR)、交叉验证标准差(SECV)和相对分析误差(RPD)。交互验证RPD及外部验证RPD分别表示RPDCV(RPDCV=SD/SEC)及 RPDval(RPDval=SD/SEP)。

2 实验结果与讨论

2.1饲料样本的近红外反射图谱 图1为未经过处理的192个饲料样品近红外反射光谱，样品原始光谱在近红外谱区出现明显吸收光谱。图2为一阶导数处理后，观察光谱的吸收峰。图3为使用二阶导数处理后，可以观察到其光谱的吸收峰更加丰富，光谱差异更加明显。已有研究表明，导数处理，特别是二阶导数处理可以产生更明显的光谱差异，并可以消除样品颗粒度差异的影响。本试验中，根据样本数据和营养指标性质的不同，采用一阶或二阶导数分别处理图谱，从中选择最佳预测效果的处理方式。

2.2饲料金霉素的定标及验证结果 本实验使用改进偏最小二乘法，用192个饲料样品建立了定标模型，为消除光谱信号的基线漂移、随机噪音及颗粒度不均匀引起的散射，光谱采用三种散射校正方法(None、SNV and Detrend、Standard MSC)和三种数学处理方法(0，0，1，1；1，4，4，1；2，4，4，1)相互任意组合，共9种光谱预处理方法，以最高交互验证决定系数(1-VR)和最低SECV值确定最佳定标模型。根据筛选，将金霉素定标结果列于表1。

图1 原光谱图

图2 无散射+一阶导数处理后的光谱

图3 无散射+二阶导数处理后的光谱

图4 标准正常化+散射处理(SNV and Detrend)处理

图5 标准多元去散射校正(Standard MSC)处理

成分/%Constituent样品数N光谱处理方式平均值Mean(ppm)定标标准差SEC交互验证标准差SECV交互验证决定系数1-VR金霉素Aureomycin192None+0,0,1,1540.00060.00070.9521金霉素Aureomycin192SNV and Detrend+0,0,1,1540.00070.00080.9424金霉素Aureomycin192Standard SMC+0,0,1,1540.00060.00070.9557金霉素Aureomycin192None+1,4,4,1540.00050.00060.9651金霉素Aureomycin192SNV and Detrend+1,4,4,1540.00050.00070.9531金霉素Aureomycin192Standard SMC+1,4,4,1550.00050.00060.9621金霉素Aureomycin192None+2,8,6,1540.00050.00070.9556金霉素Aureomycin192SNV and Detrend+2,8,6,1550.00060.00080.9411金霉素Aureomycin192Standard SMC+2,8,6,1540.00060.00080.9428

表1列出了基于定标集(N=192)所建立的九种预处理方法的相关系数均在0.941之上，说明基于傅里叶变换近红外光谱的饲料金霉素检测具有可行性。对于建立的模型，交互验证相关系数越大，交互验证标准差RMSECV 越小，说明所提取的光谱信息与分析组分的相关性越好，所得到的模型的预测能力也就越好。从表2可知其最优光谱模型是None+1，4，4，1其交互验证决定系数(1-VR)达到0.965，交互验证标准差只有0.0006，相对分析误差高达6.4 ，高于2.5%，表明所建模型可用于饲料中金霉素的检测。如表2。

表2 饲料中金霉素的最优定标结果

表3 饲料金霉素的验证结果

由表3验证结果得知，外部验证RPDval为5.0，高于2.5%，验证结果表明所建立的近红外模型预测性能较好。

3 讨论

试验结果表明，近红外漫反射光谱技术适合于不同饲料配方的检测，可在较短时间内快速检测饲料中0～130 ppm金霉素的含量，而且能达到满意的检测精度。同时，MSC、Norris 导数平滑、一阶导数、二阶导数等数据预处理方法对利用近红外漫反射无损定量检测饲料金霉素起重要作用。试验模型中包含了来自多个厂家的饲料配方，不同的饲料厂家和不同的样品来源都会对光谱产生影响。但正是在这样的复杂条件下建立的模型才有更广的适用范围。