青蒿琥酯协同5-氟尿嘧啶杀伤胰腺癌细胞及机制研究

华宏军 叶晓华 陈 媛 陈燕萍

胰腺癌被称为“癌中之王”，是一种恶性程度很高而且在所有恶性肿瘤中预后最差的肿瘤。由于胰腺癌的早期确诊率很低且肿瘤扩散很快，因此胰腺癌的手术成功率很低，五年生存率不足1%[1]。对于胰腺癌患者而言，系统性化疗是不可或缺的治疗方案[2]。5-氟尿嘧啶是一种嘧啶类广谱抗肿瘤药物，能抑制肿瘤细胞中的胸腺嘧啶核苷酸合成酶，从而干扰DNA合成，诱导肿瘤细胞发生凋亡。临床上用于消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的治疗[3-4]。然而5-氟尿嘧啶的长期大剂量使用会造成患者较大的毒副反应。本研究探讨青蒿琥酯对5-氟尿嘧啶抗胰腺癌的协同作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人胰腺癌细胞系Capan-2购于美国模式培养物保存中心(ATCC)，培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。细胞每2～3天传代1次，传代时，用胰酶消化液使细胞进入悬浮状态并用DMEM培养基洗涤2次，将细胞悬液按1:3稀释后传代。

1.2 试 剂 5-氟尿嘧啶（批号559911）、青蒿琥酯（批号 A3731）、噻唑蓝（MTT）（批号 M2128）和凋亡检测试剂盒（批号APOAF）购于德国Sigma-Aldrich。Survivin（批号 2808）、细胞色素 C（批号 4280）、凋亡诱导因子（批号5318）和GAPDH抗体（批号5174）购于美国Cell Signaling。线粒体分离试剂盒（批号C3106）和JC-1（批号C2005）购于碧云天生物科技有限公司。ECL显色试剂盒（批号32106）购于美国Pierce。Lipofectamine2000（批号 11668019）购于美国Invitrogen。

1.3 Survivin基因强制过表达和转染 将Survivin基因的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成Survivin重组质粒。Capan-2细胞接种在6孔板中孵育过夜使之贴壁。将Survivin重组质粒（终浓度为 2μg/mL）用Lipofectamine2000进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合。将贴壁的Capan-2细胞置于该无血清培养基孵育6h，之后弃去无血清培养基加入新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24h。收集细胞用于后续实验。对照细胞为Lipofectamine2000（含空质粒，终浓度为 2μg/mL）孵育 6h。

1.4 细胞活力抑制率检测 将Capan-2细胞按5×103/孔接种在96孔板上孵育过夜，使之贴壁进行分组实验。实验分为对照组（空质粒转染细胞不加药物培养48h）、青蒿琥酯组（空质粒转染细胞加入10μg/mL青蒿琥酯培养48h）、5-氟尿嘧啶组（空质粒转染细胞加入5μmol/L 5-氟尿嘧啶培养48h）、5-氟尿嘧啶+青蒿琥酯组（空质粒转染细胞加入5μmol/L 5-氟尿嘧啶和10μg/mL青蒿琥酯培养48h）和5-氟尿嘧啶+青蒿琥酯+Survivin质粒组（Survivin质粒转染细胞加入5μmol/L 5-氟尿嘧啶和10μg/mL青蒿琥酯培养48h）。分组培养完毕后在每个培养孔中加入0.1mg MTT并将细胞继续置于37°C恒温培养箱中培养4h。小心吸走孔内培养基，加入100μL二甲亚砜，充分震荡混匀后在570nm波长下测定OD值。细胞活力抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组×100%。

1.5 线粒体膜电位测定 按1.4所述进行分组培养后收集细胞，用生理盐水洗涤2次，加入终浓度为2μg/mL的JC-1染料孵育Capan-2细胞。20min后，再用生理盐水将Capan-2细胞洗涤3次，之后采用流式细胞术检测JC-1发出的红色荧光，红色荧光强度越强，则表示线粒体膜电位越高[5]。

1.6 线粒体分离 按1.4所述进行分组培养后收集细胞，用生理盐水洗涤2次，再使用线粒体分离试剂盒按说明所示步骤分离移除Capan-2细胞中的线粒体，收集无线粒体的细胞质用以检测其中的细胞色素C和凋亡诱导因子。无线粒体的细胞质中的细胞色素C和凋亡诱导因子蛋白水平越高，则说明线粒体的细胞色素C和凋亡诱导因子的释放水平越高。

1.7 Western Blot试验 按1.4所述进行分组培养后收集细胞，用生理盐水洗涤2次，用蛋白提取液提取Capan-2细胞中的总蛋白质。将等量的总蛋白质或1.6所述所得样品用10%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉对PVDF进行封闭孵育2h，之后再将PVDF膜用Survivin、细胞色素C、凋亡诱导因子和GAPDH抗体进行孵育过夜。一抗孵育完毕后的PVDF膜再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.8 细胞凋亡试验 按1.4所述进行分组培养后收集细胞，用生理盐水洗涤2次，按照凋亡检测试剂盒说明书步骤用Annexin-V和碘化丙啶（PI）对细胞进行染色孵育20min。之后采用流式细胞术检测Capan-2细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

2 结 果

2.1 青蒿琥酯对5-氟尿嘧啶有协同抗胰腺癌活性MTT实验结果显示，青蒿琥酯单独处理仅能轻微抑制Capan-2细胞的细胞活力，然而将其与5-氟尿嘧啶进行联合处理可有效提高5-氟尿嘧啶对Capan-2细胞的杀伤活性（表1）。另外，流式细胞实验结果显示，5-氟尿嘧啶+青蒿琥组Capan-2细胞的凋亡率显著高于5-氟尿嘧啶组（表1）。结果表明青蒿琥酯对5-氟尿嘧啶有协同抗胰腺癌活性。

2.2 青蒿琥酯通过对Survivin表达的抑制发挥对5-氟尿嘧啶的协同作用 Western Blot实验结果显示，青蒿琥酯能明显抑制Capan-2细胞中Survivin的表达水平（图1），表明Survivin是青蒿琥酯的作用靶点。另外，转染Survivin表达质粒能使Capan-2细胞中的Survivin发生强制过表达，废除青蒿琥酯对Survivin的抑制（图1）。MTT和流式细胞实验结果显示转染Survivin表达质粒后，青蒿琥酯对5-氟尿嘧啶的协同作用受到明显抑制，两者联合引起的细胞活力抑制和细胞凋亡明显减弱（表1）。结果表明青蒿琥酯是通过抑制Capan-2细胞Survivin表达提高其对5-氟尿嘧啶的敏感性。

2.3 青蒿琥酯促进5-氟尿嘧啶诱导的线粒体途径凋亡 流式细胞实验结果显示青蒿琥酯能明显促进5-氟尿嘧啶诱导的Capan-2细胞线粒体的失能，明显降低其线粒体膜电位（图2）。Western Blot实验结果显示，青蒿琥酯能明显促进5-氟尿嘧啶诱导的Capan-2细胞的细胞色素C和凋亡诱导因子从线粒体中释放到细胞质中（图1）。然而，当在Capan-2细胞中转染Survivin质粒使其强制表达后，青蒿琥酯对5-氟尿嘧啶诱导的线粒体途径凋亡的促进作用明显减弱（图1～2）。结果表明在胰腺癌细胞中，青蒿琥酯辅助治疗能通过抑制Survivin表达促进5-氟尿嘧啶诱导的线粒体途径凋亡。

图1 青蒿琥酯、5-氟尿嘧啶和Survivin质粒处理对Capan-2细胞Survivin表达水平及细胞色素C和凋亡诱导因子释放水平的影响

图2 青蒿琥酯、5-氟尿嘧啶和Survivin质粒处理对Capan-2细胞线粒体膜电位的影响

3 讨论

5-氟尿嘧啶是临床上治疗胰腺癌的重要化疗药物，然而胰腺癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗抵抗性是目前亟待解决的课题。研究[6-7]发现，将化疗药物与一些天然药物活性成分进行联合治疗能降低肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性，有效提高化疗药物的疗效，因此本研究探讨是否可能通过天然药物联合治疗途径提高5-氟尿嘧啶对胰腺癌细胞的杀伤活性。

表1 青蒿琥酯、5-氟尿嘧啶对Capan-2细胞活力抑制率和凋亡率的影响（%，±s）

表1 青蒿琥酯、5-氟尿嘧啶对Capan-2细胞活力抑制率和凋亡率的影响（%，±s）

注：与 5-氟尿嘧啶组比较，*P＜0.05；与青蒿琥组比较，△P＜0.05；与 5-氟尿嘧啶+青蒿琥组比较，▲P＜0.05

孔数 细胞活力抑制率组别对照组青蒿琥组5-氟尿嘧啶组5-氟尿嘧啶+青蒿琥组5-氟尿嘧啶+青蒿琥+Survivin质粒组33333 0 7.1±0.7 20.7±2.1 68.5±5.9*△26.8±2.5▲凋亡率1.8±0.2 5.4±0.6 11.3±1.5 37.9±3.2*△14.5±1.7▲

青蒿琥酯是提取自菊科植物黄花蒿叶的天然活性成分，临床主要用于疟疾的治疗。然而近期的研究[8-9]发现，青蒿琥酯除抗疟作用外，还具有一定的抗肿瘤活性，青蒿琥酯是否对胰腺癌的5-氟尿嘧啶化疗有辅助治疗作用，至今仍不清楚。本研究结果发现，青蒿琥酯能明显增强5-氟尿嘧啶对胰腺癌细胞的杀伤活性（P＜0.05），表明青蒿琥酯可以作为辅助治疗药物降低胰腺癌对5-氟尿嘧啶的抵抗性，增强其疗效。

Survivin是新发现的抗凋亡蛋白家族成员，在肿瘤细胞中对线粒体途径凋亡起负向调节作用。研究[10-12]发现Survivin在多种肿瘤细胞中高表达，并且Survivin表达水平越高，肿瘤患者的预后越差，病程进展越快。此外，Survivin的过表达还会造成肿瘤的化疗抵抗[13]，因此Survivin可作为肿瘤治疗的潜在靶点。本研究结果表明，青蒿琥酯能明显抑制胰腺癌细胞中Survivin蛋白的表达水平，从而减弱了胰腺癌细胞对凋亡信号的抵抗性。在青蒿琥酯的协同作用下，胰腺癌细胞中抗凋亡蛋白Survivin表达减少，使5-氟尿嘧啶依赖的凋亡信号更易使胰腺癌细胞进入线粒体途径的凋亡，表现为肿瘤细胞线粒体膜电位的显著下降，线粒体失能，从而使细胞色素C和凋亡诱导因子等凋亡活性分子[14-15]从线粒体中释放到细胞质中，诱导胰腺癌细胞发生凋亡性死亡。

综上所述，本研究结果显示青蒿琥酯能通过抑制Survivin的表达协同5-氟尿嘧啶杀伤胰腺癌细胞。