前处理对咖啡绿原酸高效液相色谱检测的影响

蔡嘉慧，董相书，何飞飞，郝淑美

(云南大学农学院，云南昆明 650550)

绿原酸(chromogenic acid, CGA)是咖啡豆中重要的非挥发性物质，是咖啡的杯品及风味的重要影响因素之一。 Clifford 等[1]从绿咖啡豆中分离出30多种绿原酸，其中最主要的三类是咖啡酰奎宁酸(caffeoylquinic acid, CQA)、二咖啡酰奎宁酸 (di-caffeoylquinic acid, diCQA)和阿魏酰奎尼酸(feruloylquinic acids, FQA)。绿原酸具有抗菌、消炎的功效，能预防心血管疾病、2-型糖尿病、老年痴呆症等疾病[2-3]，是一种对人类健康有益的、重要的植物衍生物[4]。绿原酸在植物体内的代谢过程中也扮演着重要的角色，是植物体内合成G型和S型木质素重要的先导物质，同时还具有保护植物细胞和抗环境胁迫等作用[5-6]。

鉴于绿原酸是衡量咖啡质量的一项重要指标，准确测量咖啡中绿原酸含量显得十分重要。目前咖啡绿原酸的提取方法主要有乙醇提取法[7]、异丙醇提取法[8]、甲醇提取法[9]、水提取法[10-11]等，检测方法常用的为高效液相色谱法(HPLC)。为进一步优化绿原酸高效液相色谱测定的前处理方法，制定快捷、有效的测定标准，笔者通过比较现有不同前处理方法下绿原酸测定结果的差异性，选择相对快速简便且安全无毒的前处理方法，以期建立准确、快速、安全的绿原酸提取测定方法，也为咖啡绿原酸的工业生化生产和咖啡品种的区别、鉴定和品质评判提供技术支持。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1咖啡样品与标准品。生咖啡豆收集自云南保山潞江坝和德宏芒市。绿原酸标准使用液(200 μg/mL)：称取绿原酸标准品(GBW09528)0.02 g于10 mL容量瓶中，加流动相溶解并定容至标定刻度线，混匀后准确吸取1 mL于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，混匀。

1.1.2主要仪器。Alliance 2695型高效液相色谱仪，色谱柱为Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，2489紫外检测器，固定相C18填料粒度5 μm，流动相A为甲醇∶乙酸=98∶2，流动相B为水∶乙酸=98∶2，按0 min(20A+80B)、10 min(45A+55B)、20 min(90A+10B)、25 min(20A+80B)极性梯度条件洗脱，柱温30 ℃，柱流量1 mL/min，波长340 nm，进样体积10 mL。

1.2方法

1.2.1液氮处理。处理1(液氮冻干)，生咖啡豆液氮冻干处理，研磨。处理2(对照)，生咖啡豆直接研磨。上述样品过40目筛，称取1.000 g咖啡粉于25.0 mL容量瓶中，加入20 mL 70%甲醇，超声波提取30 min，用70%甲醇定容，过0.45 μm 滤膜。

1.2.2提取剂筛选。

1.2.2.1水提取法。参照Surez-Quiroz等[10]的方法，取1.000 g咖啡粉于25.0 mL容量瓶中，加入20 mL纯水。80 ℃的暗环境下超声波提取30 min后纯水定容。

1.2.2.2乙醇提取法。参照刘雪飞[12]的方法，取1.000 g咖啡粉于25.0 mL容量瓶中，加入20 mL 60%乙醇，室温下超声波提取30 min，用60%乙醇定容。

1.2.2.3甲醇提取法。参照Farah等[9]的方法，取1.000 g咖啡粉于25.0 mL容量瓶中，加入20 mL 40%甲醇，室温下超声波提取30 min，用40%甲醇定容。

1.2.3生咖啡豆绿原酸含量分析。对保山和芒市收集的56个云南小粒咖啡样品，利用“1.2.1”和“1.2.2”得到的适宜的前处理方法测定其绿原酸含量。

2 结果与分析

2.1绿原酸色谱图及标准曲线对绿原酸标准品进行HPLC检测，得到标准品的绿原酸色谱图(图1)。以样品浓度x(mg/L)对峰面积y求出回归方程并绘制标准曲线。绿原酸标准曲线方程为y=1.198×107x-1 619.6，相关系数r=0.999 8。

图1 绿原酸标准品的绿原酸色谱图Fig.1 Chromatogram map of chlorogenic acid of the standard sample

2.2液氮处理的比较从表1可看出，经液氮处理后研磨的生咖啡豆绿原酸含量为47.60 mg/g，显著高于未经液氮处理的25.93 mg/g。绿原酸热稳定性差，液氮使得咖啡样品冻干，减少了研磨发热导致的绿原酸分解。因此，液氮冻干研磨显著提高了前处理的准确性。

表1液氮处理对咖啡绿原酸测定的影响

Table1Effectofliquidnitrogentreatmentonthedeterminationofcoffeechlorogenicacid

前处理方法Pretreatment method绿原酸Chlorogenic acid∥mg/g相对标准偏差RSD%相对误差Relative error∥%液氮冻干研磨Liquid nitrogen freeze-drying grinding47.60±2.48*5.213.78非冻干研磨Non-lyophilized grinding25.93±1.315.073.67

注: *表示冻干和非冻干处理间差异达到显著水平(P<0.05)

Note: * indicates that the difference between freeze-dried and non-lyophilized treatment reached a significant level (P<0.05)

2.3提取剂的比较由表2可知，乙醇和甲醇提取的绿原酸含量分别为44.60和43.70 mg/g，显著高于水提取的22.40 mg/g，此外，乙醇和甲醇提取的相对标准偏差和相对误差更小，说明其精密度更高。鉴于甲醇具有毒性，则将乙醇提取法作为该试验的推荐方法。

2.4主产区咖啡生豆绿原酸含量范围对于在咖啡主产区-保山潞江坝和德宏芒市采集的56份样品，用液氮冻干研磨-乙醇提取超声辅助的方法进行绿原酸提取，同时还测定了新绿原酸和隐绿原酸的含量，结果见表3。绿原酸含量、新绿原酸含量和隐绿原酸含量的平均值分别为35.20、3.11、5.64 mg/g,同分异构体中绿原酸比例最高，为80%。

表2不同提取剂对咖啡绿原酸测定的影响

Table2Effectofdifferentextractantsonthedeterminationofcoffeechlorogenicacid

提取剂Extractant绿原酸Chlorogenic acid∥mg/g相对标准偏差RSD%相对误差Relative error∥%水Water22.40±3.13b13.99.73乙醇Ethanol44.60±0.26a0.580.42甲醇Methanol43.70±0.71a1.621.37

注:不同提取剂间不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)

Note: Different lowercase letters betwween different extractants indicate that the difference reached a significant level (P<0.05)

表3主产区咖啡绿原酸含量范围

Table3Rangeofcoffeechlorogenicacidcontentinthemainproducingareas

指标Index含量Contentmg/g平均值Mean valuemg/g同分异构体比例Isomer ratio%绿原酸Chlorogenic acid27.70～46.6035.2080新绿原酸New chlorogenic acid1.65～5.653.117隐绿原酸Hypochlorogenic acid3.57～9.335.6413

3 讨论与结论

该试验拟通过对比液氮冻干磨样，以及水提取法、甲醇提取法、乙醇提取法3种前处理方法对咖啡中绿原酸含量检测的影响，以期建立准确、快速、安全的绿原酸提取测定方法。结果表明，与未冻干样品相比，液氮冻干的咖啡豆中绿原酸检测结果高出1倍，准确度更高，是值得推荐的绿原酸提取前处理方法。与水提取方法相比，乙醇和甲醇提取方法准确度更高，相对误差更小，特别是乙醇提取过程中不涉及有毒药品，是更为理想的绿原酸提取剂。

综合考虑提取效率及安全性，该试验确定液氮冻干研磨-60%乙醇提取为最优的绿原酸前处理方法，鉴于其精密度高、安全性高，推荐作为今后绿原酸含量检测的参考方法。