实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病田间试验药剂防治效果

唐利华，郭堂勋，李其利，黄穗萍，莫贱友

(广西农业科学院植物保护研究所/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西南宁 530007)

柑橘黄龙病(citrus huanglongbing，HLB)是世界范围内流行的毁灭性柑橘病害[1-2]，其显著特征是引起柑橘叶片黄化和果实变绿，即为“青果”或“红鼻子果”，该病害对东南亚、非洲以及中国、印度、巴西、美国佛罗里达和加利福尼亚等国家(地区)柑橘生产均造成严重的经济损失[3-5]。柑橘黄龙病的病原菌为局限于韧皮部的革兰氏阴性细菌，分为亚洲种(CandidatusLiberibacter asiaticus，Las)、美洲种(Ca. americanus，Lam)和非洲种(Ca. africanus，Laf)，亚洲种是我国柑橘黄龙病的主要病原[6]，在全世界分布最为普遍，除了非洲地区，在其他有黄龙病发生的国家均有发现[7]。目前尚无防治柑橘黄龙病的特效药剂和抗病品种，防控木虱、挖除病树和种植无病苗木是防控柑橘黄龙病的三大核心措施[8]，柑橘黄龙病防控药剂筛选研究也一直在进行[9]。越来越多的研究者通过荧光定量PCR技术追踪检测柑橘植株体内黄龙病菌的含量，以评估防控药剂对柑橘黄龙病的防控效果，荧光定量PCR检测柑橘黄龙病病原的灵敏度是常规PCR的100～1 000倍，是巢式PCR的10倍，其特异性好、灵敏度高[10-12]。笔者采用实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病田间试验药剂橘叶青的防控效果，以期进一步促进柑橘黄龙病的田间防控。

1 材料与方法

1.1材料田间试验药剂：橘叶青(美国布朗特公司研制)；柑橘品种：南丰蜜橘；检测组织：南丰蜜橘的叶片和果皮；检测技术：实时荧光定量PCR。

1.2方法

1.2.1喷施地点、时间和方法。选取南宁市武鸣区陆斡镇南丰蜜橘为试验对象，试验面积1.33 hm2，将橘叶青配制成30～36倍液，以喷雾的方式喷施植株，第1次喷施时间为2017年4月28日，第2次喷施时间为2017年7月27日。

1.2.2田间取样时间和方法。第2次喷施橘叶青90 d之后(即2017年11月3日)采集叶片和果实样品。随机选取5株不喷施橘叶青的对照植株和5株喷施橘叶青的处理植株，每株树随机采集1个叶片组织样品和1个果实样品。对照叶片组织检测编号对应为D1、D2、D3、D4、D5；处理叶片组织检测编号对应为E1、E2、E3、E4、E5；对照果皮组织检测编号对应为F1、F2、F3、F4、F5；处理果皮组织检测编号对应为G1、G2、G3、G4、G5。

1.2.3检测取样方法。取叶片组织中脉0.1 g，果皮0.2 g用于DNA提取，注意取样时不同样品勿互串污染。标准品：浓度为24 ng/μL，将标准品10倍梯度稀释，分别稀释10～105倍5个梯度作为模板和待测样品同批上机检测。

1.2.4实时荧光定量PCR反应体系(20.0 μL)。Premix ExTaq(2×,TaKaRa) 10.0 μL、引物HLBas(10 μmol/L)0.5 μL、引物HLBr(10 μmol/L)0.5 μL、探针HLBp(10 μmol/L)0.5 μL、ddH2O 7.5 μL、模板1.0 μL。每个样品设置3个重复，加样时避免交叉污染，阴性对照最后加样。引物和探针设计参考Li等[13]。

1.2.5实时荧光定量PCR反应条件。预变性 95 ℃ 30 s、变性95 ℃ 5 s、退火/延伸 60 ℃ 30 s，第2步至第3步40个循环。

2 结果与分析

从叶片组织病原菌含量检测结果看，每个样品的循环数值(Ct)重复性非常好，对照、处理的重复样品之间病原菌拷贝数差异较大，在叶片组织检测结果中对照样品D1拷贝数为584 748.55拷贝/μL，D5拷贝数为259.26拷贝/μL，相差约2 254倍，处理样品E3拷贝数为13 149.43拷贝/μL，E2拷贝数为193.26拷贝/μL，相差约67倍。在果皮组织检测结果中对照样品F3拷贝数为855 151.54拷贝/μL，F2拷贝数为248.82拷贝/μL，相差约3 435倍，处理样品G2拷贝数为134 856.85拷贝/μL，G1拷贝数为105.42拷贝/μL，相差约1 278倍。

因样品为田间随机取样，病原菌的不均匀分布造成叶片、果皮组织带菌量存在较大差异属于正常现象，但对照样品带菌量总体比喷施橘叶青后的样品带菌量高，叶片组织中对照样品平均拷贝数为125 882.69 拷贝/μL，处理样品平均拷贝数为3 492.24拷贝/μL，含菌量降低近35倍；果皮组织中对照样品平均拷贝数为211 212.88 拷贝/μL，橘叶青处理样品平均拷贝数为27 300.69拷贝/μL，含菌量降低约7倍(表1、2)。以上结果表明橘叶青对柑橘黄龙病具有一定的抑制作用，可以有效控制病原菌在柑橘植株中的发生。

表1 叶片组织病原菌含量检测结果

表2 果皮组织病原菌含量检测结果

3 讨论

从整体而言，防控木虱、挖除病树和种植无病苗木是防控柑橘黄龙病三大核心措施，可降低整个田间生态中柑橘黄龙病病原含量，就植株个体而言，一些防控技术措施可降低植株个体内含菌量，抑制还未呈明显症状的带毒植株中病原菌的扩展，目的一样，只是针对的范围、环境不同。该试验中荧光定量PCR检测结果显示同处理不同样品之间含菌量差异较大，是因为病原菌在组织中存在分布不均匀的现象，前人研究证明了这一点。Kawabe 等[14]通过荧光定量 PCR 比较分析了感黄龙病植株不同样品、不同组织的含菌量差异，发现柑橘叶柄、叶中脉的病原菌含量较高，树皮稍低，而树根最低。刘晓露[15]从田间感黄龙病沙糖橘植株上采集不同部位的叶片样品，利用探针法荧光定量PCR技术检测Las的浓度，结果发现在表现黄龙病症状的枝条上，老叶病原菌浓度最低，嫩叶稍高，成熟叶片中的浓度最高。另外，实时荧光定量PCR检测结果表明药剂橘叶青对柑橘黄龙病具有较好的防控效果，喷施2次之后降低了柑橘带菌量，可以有效控制病原菌在组织内增殖，因此该药剂可进一步作为田间防控药剂进行试验。