HPLC法测定中兽药散剂中非法添加的10种磺胺类药物

田晓玲

(辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110016)

磺胺类药物（Sulfonamides）是以对氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物，新型药物发展迅速，逐渐形成以短效、中效和长效分类的系列抗菌药物，并以疗效确切、性质稳定、价格低廉、使用方便等优势成为最广泛的临床用药之一。但由于磺胺类药物能发生过敏反应，对泌尿系统有损害，长期使用而耐药等副作用以及在动物抗感染治疗中不规范的使用，造成动物性食品中的残留对人类和环境的危害和污染。欧盟、美国等发达国家及我国都规定了磺胺类药物在动物性食品中的最高残留限量，并被列入动物食品中重点监控的药物之一。一些非法企业为谋求药效，会在中兽药散剂中添加磺胺类药物，造成动物性食品药残超标，严重威胁人类健康。检测兽药中非法添加物常用的方法有高效液相色谱法（HPLC）法和液质联用（LC-MS/MS）法[1-3]，但因串联质谱仪要求条件较高，价格昂贵，使普及应用受到限制。但现有的HPLC法同时检测的磺胺类药物较少[4-6]，在实际检测中效率不高。本研究针对兽药中非法添加的中国兽药典收载及兽医临床应用较多的10种磺胺类药物进行了HPLC方法研究，为同时检测非法添加的多种磺胺类药物提供一种灵敏、快速、低成本、高通量的新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters 2695高效液相色谱仪，Waters公司；AE260电子天平，Mettler-toledo公司；KQ-250超声波清洗器，昆山超声波仪器有限公司。

1.2 药品和试剂 磺胺嘧啶（批号100026-201404，纯度99.7%），磺胺间甲氧嘧啶（批号510093-201401，纯度97.5%），购自中国食品药品检定研究院；磺胺氯吡嗪（批号H0281308），购自中国兽医药品监察所；磺胺醋酰（批号107118，纯度99.0%）、磺胺吡啶（批号101168，纯度99.0%）、磺胺二甲基嘧啶（批号91440，纯度99.0%）、磺胺氯哒嗪（批号G119228，纯度99.1%）、磺胺甲恶唑（批号121573，纯度99.0%）、磺胺二甲氧嘧啶（批号40903，纯度99.5%）、磺胺喹噁啉（批号41219，纯度99.0%），均购自德国Dr Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇为色谱纯，FISHER公司；乙酸为分析纯；水为超纯水。

2 试验方法

2.1 色谱条件 色谱柱为C18柱，150 mm×4.6 mm（i.d.）,粒径5 μm；流动相：乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；进样量为10 μL。10种磺胺类药物在该条件下的色谱图见图1。

图110 种磺胺类药物标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of 10 sulfonamides reference

2.2 标准溶液的制备 分别精密称取10种对照品适量，置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为1 mg/mL的标准储备液。

2.3 标准曲线绘制 精密量取适量标准储备液，用甲醇稀释成浓度均为50、100、200、400、800 ng/mL的系列混合对照溶液，由低浓度到高浓度进样，外标法定量，峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标，进行回归，计算回归方程和相关系数。

2.4 供试品溶液的制备 取样品1.00±0.05 g于100 mL容量瓶中，甲醇定容，超声30 min，滤膜过滤后，供液相色谱仪测定。

2.5 检测限的测定 将适当浓度的10种磺胺类药物加入到空白中药制剂中，制成2、5、10、20 mg/g 4个浓度的添加样品，经上述方法前处理后，用HPLC检测，观察药物色谱峰信噪比（S/N）和对应药物浓度，S/N大于3者，定其为检测限。

2.6 准确度和精密度的测定 采用标准添加法，在空白制剂中（止痢散）添加5、10、20 mg/g 3个不同浓度进行回收率试验，每一浓度进行5个平行试验，分别考察3个批次，分别计算回收率和批内、批间精密度。

3 结果与讨论

3.1 线性范围10种磺胺类药物在50～800 ng/mL范围内线性关系良好，回归方程和相关系数见表1。密度见表2，止痢散添加标准品色谱图见图2。

表110 种磺胺类回归方程和相关系数Table 1 The regression equation and correlation coefficient of 10 sulfonamides

3.3 检测限 按2.5方法进行处理，当添加浓度为5 μg/g时，测得10种磺胺类药物S/N大于3，表明方法检测限为5 μg/g。

表2 止痢散添加回收率Table 2 Recovery of 10 sulfonamides from Zhili San

3.2 准确度和精密度10种磺胺类药物在5、10、20 mg/g 3个浓度添加水平的回收率及批内、批间精

图2 空白止痢散中添加10种磺胺类药物的色谱图Fig.2 Chromatograms for Zhili San spiked with 10 sulfonamides

3.4 色谱条件的优化 采用HPLC法进行多种磺胺类药物检测，鉴于多组分分离困难。本试验先后选取了乙腈-0.017 mol/L磷酸（80+20）、乙腈-甲醇-2%乙酸混合溶液梯度洗脱、乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+15+70）、乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）作为流动相，结果发现乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）既能实现10种磺胺类药物的良好分离，又能排除中兽药的其他杂质的干扰，方法简便、稳定，可操作性强。

3.5 提取条件选择 磺胺类药物常用的提取方法包括用纯有机溶剂（甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯等），或用有机溶剂添加一定比例水进行提取。本方法采用甲醇溶液作为提溶剂，简便快速，回收率满足有关要求。