研制新型布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡方法的建立与应用

魏园园

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164）

布鲁氏菌病（Brucellosis）是世界范围内非常重要的人畜共患病之一，属自然疫源性疾病。布鲁氏菌（Brucella）是布鲁氏菌病的病原菌，在自然条件下可长期潜伏存在[1]，在我国被列为二类动物疫病。国内的布鲁氏菌检测通常采用推断性诊断方法是虎红平板凝集试验（Rose bengal test，RBPT）和试管凝集试验（Slide agglutination test，SAT），但由于检测时间、血清样品用量大以及阳性检出率低等方面限制，使这两种方法具有一定的局限性[2-3]。酶联免疫 方 法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）一直是布鲁氏菌快速检测的推荐方法之一，很多学者对其在布鲁氏菌的酶联免疫检测方法上进行了优化[4]和评价[5]。刘佳等[6]通过对比试验证明ELISA抗体检测优于RBPT、SAT检测方法。除此之外，PCR检测方法也是布鲁氏菌的检测方法之一[7]。

1971年Holgate等[8]将胶体金方法引入了免疫学领域，此后胶体金免疫技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学的各领域得到了日益广泛的应用[9]。目前，在医学检验中的应用主要是免疫层析法（immunochromatography assay）和快速免疫金渗滤法（Dot-immuogold filtration assay，DIGFA），用于检测HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。胶体金免疫检测在布病检测中也相继进行了研发。通过对比其与金标免疫渗滤法和试管凝集试验，得出结论胶体金免疫方法具有试剂灵敏度和特异性，且其很小的血清用量（10 μL）更适用于临床应用[10]。由于胶体金技术优良的稳定性、灵敏度、精确度及制造过程中的可重复性，被广泛地应用在酶联免疫快速检测卡的生产上[11]，适合于广大基层检验人员以及大批量检测和大面积普查等。

本试验研发了一种高效快速的布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡，并配合胶体金试纸卡读数仪进行结果判定，进行了灵敏度、稳定性和批次间稳定性等试验，此外还结合虎红平板凝集试验进行了对比，对这一市场新产品进行了评价。

1 试验材料

1.1 主要试剂和仪器三维划膜喷金仪HM3030、金标试纸分切机WM-100（上海金标）；连续点膜机R5DD-2（韩感）；胶体金试纸卡读数仪GA01来自北京大有泰莱生物技术有限公司。

1.2 试剂布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原、阳性血清、阴性血清、猪蓝耳病阳性血清，中国兽医药品监察所生产。布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒，北京大有泰莱生物技术有限公司。其他建立胶体金免疫层析方法的试剂和耗材由北京金申中合科技有限公司提供。

2 试验方法

2.1 胶体金检测卡的制备

2.1.1 4B8单克隆抗体IgG杂交瘤细胞株建立参考方法[12]进行免疫、细胞融合、克隆和单克隆抗体杂交瘤细胞株制备。参考方法[11]进行抗体的纯化及包被。

2.1.2 胶体金溶液的制备量取40 mL纯水，加热至沸腾后，加入0.04 mL 10%氯金酸溶液。于5 min后加入0.096 mL的10%柠檬酸三钠溶液，继续煮10 min。待溶液温度降至室温后，将pH调节至8.2，装入棕色瓶中，于室温保存。

2.1.3 抗体与胶体金结合 取1.5 mL离心管，加入胶体金500 μL，加入30 μg/mL的抗体溶液，混匀后于室温下放置15 min。加入100 μL 10%NaCl，放置10 min。

2.1.4 检测卡的制作和组装 参照方法[13]进行金标抗体结合垫的制备、划膜和检测卡组装工作，将检测卡置于装有干燥器的自封袋中备用。

2.2 胶体金检测卡评价

2.2.1 灵敏度评价将布鲁氏菌阳性血清制备至试管凝集试验1:400效价后，用0.01 mol/L PBS稀释为1:400、1:200、1:100、1:50、1:25、1:12.5、1:6.25、1:3.125、1:1.56、1:0.78、1:0.39、1:0.2、1:0.1和1:0.05后，分别进行布鲁氏菌抗体胶体金检测卡的检测：在检测板加样孔中加10 μL被检血清，4 min后将显色后的试纸卡插入胶体金试纸卡读数仪，进行读数后记录数据，以血清浓度为横坐标、T/C值为纵坐标，用RIDAWIN软件（Biopham，美国）拟合标准曲线方程，进行灵敏度评价。以下试验的胶体金读数仪数值将依照此判定标准进行判定。

2.2.2 特异性评价 将猪蓝耳病阳性血清进行布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡检测。

2.2.3 批内和批间重复性评价 将同批和不同批次的布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡分别检测上述阴性样品、阳性样品、实测阳性样品，每个浓度重复3次，观察其重复性。

2.2.4 临床样品灵敏度评价选取22份布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒（北京，大有泰莱）测定为阳性的羊血清样本，利用布鲁氏菌抗体胶体金检测卡检测。阳性对照为实验室保存的1:400效价的阳性血清；阴性对照为布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒检测的布鲁氏菌为阴性的牛血清。

选取20份布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒测定为阴性的羊血清样本，利用布鲁氏菌抗体胶体金检测卡检测。阳性对照为实验室保存的1:400效价的阳性血清；阴性对照为布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒检测的布鲁氏菌为阴性的牛血清。

2.3 胶体金检测卡和虎红平板检测方法的灵敏度评价对比按照《动物布鲁氏菌病诊断技术（GB/T18646-2002）》中的方法进行虎红平板凝集方法检测。在载玻片上滴加0.03 mL被检血清后，滴加0.03 mL虎红平板抗原，摇匀静置，4 min后判定结果。室温条件下操作，肉眼观测进行判定。将2.2.1同样血清浓度利用虎红平板试验进行检测，将检测结果与胶体金检测卡结果对比。

选用2.2.4的22份临床阳性样本进行虎红平板凝集方法检测，并将检测结果与胶体金检测卡结果对比。

3 试验结果

3.1 胶体金检测卡灵敏度评价

3.1.1 灵敏度评价将检测卡从1:400效价血清以2倍倍比稀释，试纸可以检测至1:0.39稀释度（图1）。

3.1.2 灵敏度标准曲线确立将阳性血清按照1:400、1:200、1:100、1:50、1:25、1:12.5、1:6.25、1:3.125、1:1.56、1:0.78、1:0.39、1:0.2、1:0.1、1:0.05的2倍倍比稀释。利用读卡仪进行T/C值记录，以T/C值为纵坐标，血清浓度为横坐标，使用RIDAWIN软件（Biopham，AZ，US）拟合标准曲线，Y=1.884+0.144lnX（R2=0.9910），最低检出限为1:0.39，即判定标准为胶体金试纸卡读数仪的T/C值≥0.14为阳性。

3.1.3 胶体金检测卡和虎红平板的灵敏度评价为了对比布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡和虎红平板检测方法的灵敏度，将试管凝集试验1:400效价的阳性血清做2倍倍比稀释。通过对照判定标定值，胶体金可检测到第11个稀释度1:0.39，虎红平板凝集试验可检测到第6个稀释度1:12.5（图2）。结果表明布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡的灵敏度远远高于虎红平板，更适合于布鲁氏菌的快速检测。

图1 布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡的灵敏度试验Fig.1 Sensitivity test of the colloidal gold strips test on Brucella serum

图2 布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡和虎红平板的灵敏度对比试验Fig.2 Sensitivity test of rose bengal plate agglutination test onBrucella

3.2 胶体金快速检测卡和虎红平板的阳性检出率对比试验为了对比布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡和虎红平板检测对于已知阳性样本的阳性检出率，本试验将这两种方法分别检测了22份布鲁氏菌临床阳性羊血清样本。通过对比金标仪曲线值，得出结论：布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡在22份阳性样品中分别检测出阳性率90.91%，而虎红平板检测方法阳性率为81.81%（表1）。

在20份布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒测定为阴性的羊血清样本中，布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡和虎红平板检测方法的阳性检出率均为0%，阴性检出率均为100%。

表1 阳性样本布鲁氏菌抗体胶体金检测卡通过读卡仪的判定结果和虎红平板凝集试验结果Table 1 colloid gold reader result on colloidal gold strips test and rose-bengal plate agglutination test

通过对比胶体金布鲁氏菌快速检测卡和虎红平板检测方法的已知阳性样本的阳性检出率，得出结论：胶体金检测卡的阳性检出率高于虎红平板检测方法9.10%，更适合于布鲁氏病的临床快速检测。

3.3 布鲁氏菌胶体金快速检测卡的特异性评价猪蓝耳病阳性血清的布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡检测结果为阴性。

3.4 布鲁氏菌胶体金快速检测卡的批内和批间重复通过对比3个批次的布鲁氏菌抗体胶体金快速检测卡，批内和批间的稳定性及色度辨析度良好，检出率一致。

4 讨论

本试验应用胶体金免疫层析技术，成功建立了针对布鲁氏菌抗体的胶体金检测卡方法，大大降低了检测时间和检测成本。通过阳性样本的梯度浓度判读结果表明，将试管凝集试验1:400效价的阳性血清做2倍倍比稀释，布鲁氏菌抗体胶体金检测卡的灵敏度为第11个稀释度；其检测最快观察时间为3 min；通过多批次检测卡测试，批内和批间重复性为100%；阳性检出率为90.91%。本试验证实，本自研布鲁氏菌抗体胶体金检测卡的灵敏度低于ELISA，高于虎红平板凝集试验，灵敏度是虎红平板凝集试验的32倍，可用于布鲁氏菌临床样品的临床快速检测，是布病检测工作的检测利器。

董浩等[14]通过对比虎红平板和胶体金免疫层析法在牛血清和羊血清的阳性检测率试验，证明胶体金免疫层析法的检出率高于虎红平板凝集试验，初步证实胶体金敏感度高于凝集试验。制作的布氏杆菌抗体胶体金免疫层析方法与虎红平板相比具有更高的阳性率。除此之外，由于目测检测卡结果受到光线、个人视力辨识度等因素影响，容易存在错录和漏录等风险。采用了胶体金读卡仪，通过灵敏度对照图确定了阳性读数值，避免了个人因素影响，增加了检测的准确度，可作为未来疫病检测的推荐使用方法。