大黄附子汤加味对脓毒症大鼠小肠运动水平及黏膜通透性的影响*

刘福生 方晓磊 袁斯远 郑香春 刘 锦

王潇慧2 孙江燕2 王 秋2 吴 婧2 王苏妹1△

（1.北京中医药大学东方医院，北京 100078；2.北京中医药大学，北京 100029；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

脓毒症（Sepsis）是指由感染引起的宿主反应失调导致的器官功能障碍；脓毒症和脓毒症休克是多器官功能障碍综合征（MODS）的重要原因［1］。脓毒症属于本虚标实证，扶正祛邪是治疗脓毒症的重要治法。早期扶正与祛邪并举的治疗方案有助于降低脓毒症患者的病死率［2］。通里攻下法的代表药大黄是治疗脓毒症最早、最多的单味中药之一［3］，大黄类制剂可以降低脓毒症患者的死亡率［4］。大黄附子汤出自《金匮要略》，是温下剂的代表方，由大黄、附子、细辛3味药物组成，全方既有大黄通里攻下以祛邪，又有附子、细辛温里散寒以扶正，寒温并用，切合脓毒症本虚标实的病机。本研究采用大黄附子汤加味对脓毒症大鼠干预，观察温下法对脓毒症大鼠小肠运动及肠黏膜通透性的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48只SPF级Wistar雄性大鼠购于北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号：（京）2016-0011。体质量200～240 g，饲养于北京中医药大学动物房。所有动物饲养在（60±5）%湿度、（20±2）℃温度及 12 h 光照/12 h黑暗交替周期环境中。

1.2 药物及试剂

大黄附子汤加味（组成：生大黄9 g，炮附子15 g，细辛3 g，僵蚕 6 g，蝉蜕 3 g，姜黄 6 g）颗粒剂购自北京康仁堂药业有限公司。枸橼酸莫沙必利 （国药准字H19990317，购自鲁南贝特制药有限公司）。离心机，微量移液器及酶标仪（Thermo Scientific，USA），显微镜（OLYMPUS U-CMAD-2），图像采集系统（Nikon DSFi2）。 大鼠胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）、D-乳酸及PCT检测试剂盒购自北京百奥思科生物医学技术有限公司，移液器吸头（10 μL及200uL），冻存管及采血管购自北京泰科美生物科技有限公司。

1.3 造模及分组

48只SPF级Wistar大鼠随机分为正常对照组10只，其余38只大鼠采用盲肠结扎穿孔法复制大鼠脓毒症模型［5］，方法如下：术前禁食 12 h，10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉，备皮、碘伏消毒腹部，取下腹正中切口2 cm入腹以暴露盲肠。在盲肠远端1/2处用无菌4号丝线紧紧结扎，用无菌中号圆针带7号丝线缝穿结扎盲肠远端，并将7号丝线双股打结，留约直径2 cm的线环。用1 mL注射器向已结扎盲肠远端注射0.9%氯化钠注射液0.5 mL，分2层关腹，制成脓毒症大鼠模型。造模成功的36只大鼠随机分为模型对照组、中药组与西药组，各12只。

1.4 干预方法

造模成功后各组大鼠均禁食不禁水饲养，中药组大鼠予大黄附子汤加味中药（4 mg/kg）灌胃，每24小时2次。西药组给予枸橼酸莫沙必利（1.5 mg/kg）灌胃，每24小时2次。正常对照组和模型对照组予等量灭菌注射用水灌胃。各组观察时间为24 h。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 各组大鼠小肠组织病理观察 造模后24 h后将12%碳末混悬液0.2 mL/10 g灌胃。20 min后4%水合氯醛麻醉后取材。主动脉取全血，离心后分装-80℃以待测定；分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管；剪取距盲肠根部小肠2 cm，解开肠管，使用PBS冲洗干净肠内容物后放入10%甲醛溶液固定，24 h后石蜡切片做HE染色观察大鼠小肠组织病理。

1.5.2 小肠碳末推进百分率测定 取材前将12%碳末混悬液0.2 mL/10 g灌胃。20 min后处死动物。剖开腹腔，分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管。轻轻将肠管拉直，准确量取幽门至碳末推进前沿的长度以及小肠总长度。按照公式计算：（从幽门部到碳末推进前沿的推进距离/大鼠小肠总长）×100%计算小肠碳末推进百分率。

1.5.3 大鼠血清降钙素原（PCT）测定 采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法免疫发光法（ELISA）检测。根据本实验确立的脓毒症判断指标和标准确定大鼠脓毒症模型制作成功，根据统计学原理算出占正常大鼠95%的血清PCT的正常值；造模后血清PCT高于正常值2个及以上标准差为脓毒症造模成功的判断标准。根据该模型约术后12 h开始出现脓毒症表现，72 h死亡率约75%～85%。

1.5.4 大鼠D-乳酸、GAS及MTL的含量测定 釆用酶联免疫吸附法（ELISA）在多功能酶标仪中测量待检样品的吸光值（A），按照试剂盒说明的各项步骤进行检测。根据酶标仪检测的吸光值，利用标准曲线的二次方程式计算得出待检样品中D-乳酸GAS及MTL的含量（pg/mL）。

1.6 统计学处理

应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，符合正态分布组间比较采用单因素方差检验，计数资料采用率表示，组间对比比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠死亡率比较

造模后24 h后正常对照组大鼠无死亡；模型对照组与西药组大鼠死亡4只，死亡率33.33%；中药组大鼠死亡2只，死亡率16.67%，低于模型组和西药组（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠小肠黏膜病理改变

见图1，图2。光学显微镜下假手术组大鼠各时间点小肠黏膜组织结构完整，肠绒毛排列整齐，清晰可见浆膜层、肌层、固有层以及黏膜层，甚至可见黏液层。模型对照组、中药组和西药组大鼠小肠黏膜厚度明显变薄，肠绒毛排列不整齐，部分区域有绒毛上皮剥离，局部可见固有层崩解，绒毛增粗缩短，可见局部炎症细胞浸润。与西药组和模型组对比，中药组大鼠小肠黏膜厚度稍增厚，局部炎症细胞浸润减少。

图1 各组大鼠小肠黏膜病理改变 （HE染色，100倍）

图2 各组大鼠小肠黏膜病理改变 （HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠小肠黏膜损伤指数、D-乳酸及PCT含量比较

见表1。与正常对照组比较，中药组、西药组与模型对照组小肠黏膜损伤指数、D-乳酸及PCT水平均增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，西药组小肠黏膜损伤指数、D-乳酸及PCT水平差异无统计学意义 （P＞0.05）；与模型对照组和西药组比较，中药组小肠黏膜损伤指数、D-乳酸及PCT水平均降低（P＜0.05）。

表1 各组小肠黏膜损伤指数、D-乳酸及PCT含量比较（±s）

表1 各组小肠黏膜损伤指数、D-乳酸及PCT含量比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与西药组比较，▲P＜0.05。 下同

组 别 n 小肠黏膜损伤指数评分（分）D-乳酸（μg/mL）PCT（μg/L）正常对照组 10 0.38±0.02模型对照组 8 1.05±0.08*西药组 8 0.99±0.12*0.27±0.34 7.70±1.41 4.25±0.62* 11.16±0.75*3.41±0.46* 10.43±0.45*中药组 10 0.82±0.08*△▲1.92±0.59*△▲ 8.90±0.64*△▲

2.4 各组大鼠小肠传输率、MTL及GAS比较

见表2。与正常对照组比较，中药组、西药组及模型对照组小肠传输率、MTL及GAS均明显减低（P＜0.05）；与模型对照组比较，中药组和西药组小肠传输率、MTL及GAS均明显升高（P＜0.05）；小肠传输率、MTL及GAS在中药组和西药组之间无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠小肠传输率、MTL及GAS比较（±s）

表2 各组大鼠小肠传输率、MTL及GAS比较（±s）

组 别 n GAS（pg/mL）小肠传输率（%） MTL（pg/mL）正常对照组 10 147.64±37.96模型对照组 8 57.14±3.75*西药组 8 67.51±2.48*△71.00±10.00 40.54±22.67 22.00±8.00* 18.53±1.22*40.00±9.00*△ 33.56±1.52*△中药组 10 66.88±2.63*△45.00±14.00*△ 32.11±2.22*△

3 讨 论

脓毒症的致病机制十分复杂，涉及病原微生物、宿主炎症反应失衡、免疫功能紊乱、肠道微生态、凝血异常以及神经-内分泌-免疫网络、线粒体损伤、内质网应激、细胞自噬、基因多态性等多方面病理生理变化［6］。胃肠功能紊乱已成为判断MODS患者预后的一个重要条件，日益引起研究者的重视［7-8］。由于炎症介质大量释放，脓毒症患者毛细血管渗漏及血管舒缩障碍都会累及胃肠功能。当胃肠功能受到损伤后，影响肠道菌群及其产物的吸收和调控功能，进而影响胃肠肠道黏膜屏障、免疫功能及内分泌功能，同时肠道作为体内最大的“储菌库”和“内毒素库”，其黏膜功能受损导致细菌移位，进一步加重脓毒症的进展［9］。目前脓毒症的治疗强调集束化治疗，目前中医药治疗脓毒症治法有清热解毒法、通里攻下法、活血化瘀法与扶正固本法［10］。脓毒症属于本虚标实证，合并肠功能障碍的脓毒症患者的中医证型分布以虚证和虚实夹杂证占有更大比例［11］，大量使用抗生素的情况下往往存在正气不足，若单纯辅助正气容易助邪、单用驱邪容易伤及正气，不利于疾病转归。基于以上病机及困境，大黄附子汤加减为代表的温下法治疗危重症胃肠功能障碍具有较好的疗效［12］，能改善脓毒症患者炎症状态和胃肠功能障碍、降低死亡率［13-14］。

为观察温下法治疗脓毒症的疗效并探讨其机制，本研究以CLP诱导脓毒症大鼠为载体，观察大黄附子汤加味对脓毒症大鼠小肠运动及肠黏膜通透性的影响。基于评价大黄附子汤加味对脓毒症大鼠小肠运动及肠黏膜通透性，因此选用临床常用胃动力药枸橼酸莫沙必利作为阳性对照［15］。D-乳酸主要来源于胃肠道细菌的酵解，在重症感染患者早期即存在升高，且可预测感染性休克的发生［16］，感染、缺血和创伤性休克都能导致血中D-乳酸浓度的升高［17］。当严重感染、休克、Sepsis及MODS时，PCT在血浆中的表达水平升高。小肠传输率可以反应肠运动。GAS短期作用是刺激胃酸的分泌，长期作用是促进胃點膜增生，促进胃肠道分泌和运动，增强胃肠和胆囊收缩功能等。MTL具有刺激上消化道机械运动和生理机电活动，加强结肠运动和胆囊收缩等作用。危重症患儿血液GAS、MTL等水平与病情危重程度有关，病情越重GAS和MTL水平越高［18］。本研究综合病死率、小肠黏膜损伤程度、D-乳酸、PCT、小肠传输率、MTL及GAS作为评价大黄附子汤加味治疗脓毒症的疗效和机制指标。

本研究大黄附子汤加味由大黄附子汤联合升降散，大黄附子汤出自《金匮要略》，是温下剂的代表方；升降散升清降浊、散风清热，治温病表里三焦大热。由生大黄、炮附子、细辛、僵蚕、蝉蜕、姜黄组成。大黄清热通腑、活血解毒，附子温阳祛寒，大黄藉附子之大热，其寒性去而走泻之性得存，具有通腑活血解毒功效；细辛辛散温通，可宣通阳气，僵蚕清热解郁，善能升清散火；蝉蜕清热解表，宣毒透达；姜黄辛苦性寒，善能行气活血解郁，散肌表之毒邪。全方祛邪扶正，升降同调，寒温并用，切合脓毒症本虚标实的病机。结果显示，与模型组对比，大黄附子汤加味可以降低脓毒症大鼠的死亡率、小肠黏膜损伤程度、D-乳酸、PCT，改善小肠传输率、MTL及GAS，提示大黄附子汤加味可能通过促进肠道运动、改善肠黏膜损伤及通透性从而调节炎症状态发挥治疗脓毒症的作用。与西药组对比，大黄附子汤加味可以降低脓毒症大鼠的死亡率、小肠黏膜损伤程度、D-乳酸和PCT水平，在改善小肠传输率、MTL及GAS组间无明显差异，提示大黄附子汤加味具有莫沙比利改善胃肠运动的作用，还能改善肠黏膜损伤及通透性，这与研究表明大黄附子汤可减轻失血性休克复苏后肠道黏膜屏障损伤［19］及改善胰腺炎患者机体炎症状态［20］结果具有类似之处。

综上所述，大黄附子汤加味可促进肠道运动，改善肠黏膜通透性，调节肌体炎症状态，降低死亡率，发挥治疗脓毒症的作用。大黄附子汤是温下法的代表方，因此温下法可能通过调节肠道运动和肠黏膜通透性调节炎症状态发挥治疗脓毒症的作用，为温下法治疗脓毒症（阳虚腑实证）提供一定的依据。