高强度超声对鹅胸肉嫩度及品质的影响

张 坤，王道营，张 淼，诸永志，邹 烨,*，徐为民,3,*

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210046；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

我国有悠久的养鹅历史，是世界上养鹅数量最多、品种最丰富的国家[1-2]。鹅肉作为高蛋白、低胆固醇、低脂肪的绿色营养健康食品，具有药用、食疗功能[3-4]。我国鹅肉产量大，但鹅肉肌纤维粗、硬度较大、嫩度差、不易咀嚼[5]，在一定程度上限制了人们的消费，因此急需选择合适的加工技术改善鹅肉的品质，促进鹅肉产业快速稳定发展。目前，关于改善肉品品质的方法研究较多，主要包括物理法[6-7]、化学法[8-9]、生物法[10-11]，其中物理方法简单安全、实践应用最广，但可选的方法较少。超声嫩化是90年代提出的一种与其他的肉类嫩化原理不同的全新嫩化技术，现普遍认为其空化效应、热效应和机械作用是超声技术的三大理论依据，“声耦”作用使肉产生振动，致使肌肉结构破坏，快速嫩化肉品[12]。Lyng[13]、Chemat[14]等均研究发现超声可用于提高肉品嫩度。近年来，国内也有关于超声对肉品嫩度影响的研究[15-16]，结果均表明超声对肌肉有显著嫩化作用。但是，关于超声嫩化方法对肉品品质的影响及嫩化原理仍需进一步研究。本研究通过分析超声处理鹅胸肉的pH值、肌原纤维小片化指数（muscle fibrillation index，MFI）、剪切力、热力学变化等指标，研究其成熟过程中肉品品质的变化规律，为探究鹅肉嫩化机理、进一步提高肉品品质提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉用扬州鹅购自常州市阳湖养鹅业专业合作社，随机选取90 日龄左右大小相近的健康鹅，按要求宰杀，并迅速取出鹅胸肉，待用。

二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 南京奥多福尼生物科技有限公司；KCl、NaCl、Na2CO3、NaHCO3（均为分析纯） 西陇化工股份有限公司；乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylene glycol bis(2-aminoethylether)tetraacetic acid，EGTA） 上海麦克林公司。

1.2 仪器与设备

超声细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；HI-9025酸度计 意大利Hanna公司；UV-6100紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；TVT-300XP质构仪 瑞典泰沃公司；T-25型数显匀浆机德国IKA公司；UniCenMR冷冻离心机 德国Herolab公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直电泳系统美国Bio-Rad公司；JS-680C全自动凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司；EVO-LS10扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM） 德国ZEISS Oberkochen公司；Q2000差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）仪 美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1 实验材料处理

将选取的肉鹅按要求宰杀后，迅速取出胸大肌，选取大小、薄厚相近的鹅胸大肌，剔除肌膜、结缔组织和脂肪组织，待用。

取上述鹅胸大肌，分两组处理：其中一组进行超声（功率800 W、时间42 min）处理，另一组未经超声处理的鹅胸大肌作为对照组（常规组）。于4 ℃放置不同时间（0、6、12、24、36、48 h）后分别取样，经液氮速冻后放入-40 ℃冰箱，待用。每组均做3 个平行。

1.3.2 肉品pH值的测定

称取2 g肉糜于离心管中，加入18 mL去离子水，玻璃棒搅匀后用酸度计测定其pH值，测定3 次取平均值。

1.3.3 MFI值的测定

参考Culler等[17]的方法测定MFI值：称取2 g肉糜，加入20 mL MFI提取缓冲液（0.1 mol/L KCl、l mmol/L NaN3、7 mmol/L KH2PO4、18 mmol/L K2HPO4、l mmol/L MgCl2、l mmol/L EGTA，pH 7.0、4 ℃），冰浴均质（1 2 0 0 0 r/min、3 0 s、2 次），冷冻离心（12 000×g、15 min、4 ℃），弃上清液，沉淀加20 mL MFI提取缓冲液，再次离心（12 000×g、15 min、4 ℃），弃上清液，沉淀加15 mL MFI提取缓冲液，搅匀，经两层纱布过滤，滤液即为肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）溶液。MP溶液用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白质量浓度，用MFI提取缓冲液调节MP质量浓度为0.5 mg/mL，将稀释的MP溶液摇匀，立即用紫外-可见分光光度计测定其在540 nm波长处吸光度，测定3 次取平均值。MFI值为540 nm波长处吸光度乘200。

1.3.4 蒸煮损失率、中心蒸煮速率的测定

鹅胸肉块（（50±5）g）用滤纸吸干表面水分后称质量，记录蒸煮前肉块质量m1。然后将肉块置于5 号自封袋中，将数显温度计插入肉块中央。在95 ℃水浴锅中加热至中心温度75 ℃，立即取出流水冲至室温，再次用滤纸吸干表面水分后称质量，记录蒸煮后肉块质量m2。根据蒸煮前后肉块质量按下式计算得出肉块蒸煮损失率。

蒸煮损失率测定过程中，记录各肉块达到30、40、50、60、70、75 ℃时所用时间（起始温度均为12 ℃），计算鹅胸肉中心蒸煮速率。

1.3.5 剪切力的测定

将1.3.4节蒸煮后的肉块用手术刀和直尺沿肌纤维方向切割成3 cm×1 cm×1 cm大小的肉条，使用TVT-300XP质构仪连接的刀片式探头，垂直肌纤维的方向进行剪切，测定其剪切力变化曲线，记录最大剪切力，多次测定取平均值。剪切力的测定参数设定为：测前速率：10 mm/s；测试速率：2 mm/s；测后速率：10 mm/s；下降距离：30 mm；触发力：50 g。

1.3.6 MP的提取

参考Xiong Youling L.[18]的方法提取MP。取2 g鹅胸肉切碎，加8 倍分离缓冲液（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、0.5 mmol/L DTT、10 mmol/L K2HPO4，pH 7.0），冰浴均质（10 000×g、10 s、3 次），离心（2 000×g、20 min），弃上清液，取沉淀，重复3 次。加入8 倍分离缓冲液（0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L NaN3，pH 6.0），均质（10 000 r/min、10 s）后用一层干燥洁净的纱布过滤，离心（2 000×g、20 min），弃上清液，取沉淀，重复3 次，得到提纯的MP沉淀。将沉淀溶于适量的缓冲液（0.6 mol/L KCl、10 mmol/L K2HPO4，pH 6.0）中，待用。

1.3.7 SDS-PAGE分析

取0.2 mL 1.3.6节提取的MP溶液，加入0.4 mL上样缓冲液后于95 ℃加热5 min灭酶，离心（12 000×g、5 min）取上清液用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。采用变性不连续电泳，质量分数12%分离胶、5%浓缩胶（m（丙烯酰胺）∶m（甲叉双丙烯酰胺）＝36.5∶1）。每孔等体积上样20 µL，200 V恒压电泳约50 min。凝胶块用考马斯亮蓝染色液染色10 min后取出，加入适量的脱色液，脱色时放在摇床上使脱色更为均匀迅速，1 h后更换脱色液，直至脱色完成，用凝胶成像仪对胶块进行成像分析，并用ImageJ软件扫描条带，得出OD值用于数据分析。

1.3.8 超微结构分析

鹅胸肉样的微观结构用SEM观察。将处理好的肉样切成5 mm×2 mm×2 mm小块，用体积分数3%戊二醛固定，喷金镀膜后用SEM观察样品的超微结构。

1.3.9 热力学性质变化分析

以DSC测定样品热重（thermogravimetric，TG）/DSC曲线，由变性温度（Tg）表征蛋白质样品的热稳定性。铝坩埚中放入12 mg左右的鹅胸肉样品。温度范围25～105 ℃，升温速率5 ℃/min，测定其TG/DSC曲线。通过TA Universial Analysis软件对热变曲线中的峰处理以得到热变性温度（Tm），对其面积积分后得出焓变（ΔH）。

1.4 数据分析

采用Excel软件统计数据。用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析和相关性分析。分析统计图使用Origin 8.0软件绘制。采用Dunnett-t进行显著性和相关性分析，以P＜0.05表示差异或相关性显著。

2 结果与分析

2.1 鹅胸肉糜pH值的变化

pH值是反映肉品品质的重要指标之一[19]。宰后成熟过程中，肌肉pH值先下降后回升：成熟前期，乳酸的累积导致pH值的下降；在后熟期，肌肉转化为可食用肉的过程中，pH值回升，肉质变嫩。

图 1 超声处理后放置时间对鹅胸肉pH值的影响Fig. 1 Effect of storage time after ultrasonic treatment on pH of goose breast meat

如图1所示，未超声处理的常规组鹅胸肉pH值随放置时间的延长先降低后升高，pH值降低过程符合肌肉宰后成熟前期排酸规律，即动物宰后肌肉僵直期，由于氧气供应中断，肌肉内糖酵解生成乳酸，肌肉的排酸过程导致内部环境pH值下降，同时，糖酵解产生的ATP不足以维持肌肉的正常ATP水平，肌动蛋白与肌球蛋白结合生成肌动球蛋白，使肉品品质改变，嫩度减小。随着放置时间的延长，肌肉进入解僵期，肌动球蛋白解离，pH值回升，肌肉重新变柔嫩。

超声组pH值随放置时间的延长先增大后降低。同时，超声组pH值普遍高于常规组，这可能是因为超声的强穿透力以及空化效应使组织结构在短时间内遭到破坏，释放嫩化酶，缩短肌肉宰后成熟过程，使肌肉快速进入后熟期，从而使pH值升高，进一步利于肉质嫩化。这与高海燕等[20]的结论相似，在尸僵阶段，宰后鸡肉pH值持续下降，此时肉的持水性最差，在后熟阶段，肌肉的pH值又开始回升，远离蛋白质的等电点，肉的保水性也提高，变得柔嫩多汁。这说明超声处理有助于缩短肌肉成熟过程，对肌肉品质有显著影响。

2.2 鹅胸肉糜MFI值的变化

鹅宰后僵直成熟过程中，完整的肌原纤维断裂成肌节小片，MFI是衡量动物宰后肌原纤维随时间变化的参数，可作为表征嫩度的重要指标[21]，MFI值越大，肌原纤维内部结构破坏程度越大。

由图2可看出，超声组的MFI值显著大于常规组，随着放置时间的延长，超声组MFI值变化不明显；常规组MFI值随着放置时间的延长不断增加，放置时间48 h时常规组MFI值接近超声组初始放置时间的MFI值。这与李诚等[22]的研究结果相符，宰后成熟初期MFI值增加不明显，随着宰后成熟时间的延长，由于肌肉中组织蛋白酶及其他因素的影响，肌原纤维降解，肌原纤维的结构遭到破坏，完整的肌原纤维断裂形成肌节小片，MFI值显著增加，成熟72～96 h后，MFI值增加幅度逐渐减小，因此在成熟后期MFI值变化不显著。以上结果表明，超声具有的强穿透力和空化效应等，可以促进组织结构破坏，肌原纤维、结缔组织等在短时间内遭到破坏，一方面释放嫩化酶，另一方面，肌纤维破碎断裂成为肌节小片，小片化程度在短时间内显著增大。因此，超声处理使鹅胸肉MFI值在短时间内达到成熟后期水平，缩短了鹅胸肉宰后成熟期，有助于改善肉质嫩度，这也与pH值的分析结果一致。

图 2 超声处理后放置时间对鹅胸肉MFI值的影响Fig. 2 Effect of storage time after ultrasonic treatment on MFI of goose breast meat

2.3 鹅胸肉块中心蒸煮速率的变化

图 3 超声处理后放置时间对鹅胸肉中心蒸煮速率的影响Fig. 3 Effect of storage time after ultrasonic treatment on cooking rate of goose breast meat

由图3可知，与常规组相比，超声组的中心温度变化更快，加热到所需温度需要的时间更短。鹅胸肉中心温度在20～75 ℃范围内，两组中心温度上升速率均有显著性差异（P＜0.05）。随着中心温度的继续升高，两组鹅胸肉加热到同一温度时消耗的时间也存在显著性差异（P＜0.05），超声组的中心温度达70 ℃时，常规组仅为60 ℃。由此可知，超声处理能够缩短鹅胸肉的煮制时间，超声组相对于常规组对热能的利用效率更高。

2.4 鹅胸肉块蒸煮损失率的变化

由图4可知，超声组的蒸煮损失率呈先下降后上升的趋势，与常规组相比，超声对蒸煮损失率的影响在宰后成熟前期比较明显。常规组的蒸煮损失率呈先上升后下降趋势，蒸煮损失率在放置12 h时达到最高，这是因为宰后肌肉先经过僵直阶段，肌肉嫩度下降，保水性降低，在随后解僵阶段，肌肉嫩度回升，保水性提高，从而使蒸煮损失率降低。而超声组的蒸煮损失率在放置6 h时最低，且超声处理显著减小了鹅胸肉的蒸煮损失率，这可能是因为其加速了宰后成熟过程，使蒸煮损失率降低，这与刘功明等[23]的结果相符。这是由于超声处理破坏了细胞结构，促使肌细胞内Ca2+外流，活化钙激活酶，进而促进了MP的分解，提高了肉的嫩度。同时，超声处理在一定程度上促进了盐溶性蛋白向肉表面的富集，提高肉块表面阻止水分向外扩散的能力；而且超声的空化效应可以穿透组织内部，破坏肉的肌原纤维结构，释放出更多的盐溶性蛋白，增强肌肉蛋白结合水的能力，减少在加热过程中肉汁的外溢，有效减小蒸煮损失[24-25]。

图 4 超声处理后放置时间对鹅胸肉蒸煮损失率的影响Fig. 4 Effect of storage time after ultrasonic treatment on cooking loss of goose breast meat

2.5 鹅胸肉块剪切力的变化

图 5 超声处理后放置时间对鹅胸肉剪切力的影响Fig. 5 Effect of storage time after ultrasonic treatment on shear force of goose breast meat

剪切力是反映肌肉嫩度的直接指标，剪切力越大肌肉越嫩，剪切力的大小与肌纤维直径、水分含量、成熟程度等密切相关[23]。如图5所示，超声组的剪切力呈先下降后上升的趋势，而常规组有相反的趋势，且超声组的剪切力显著低于常规组，与蒸煮损失变化趋势基本相同。超声处理可以在较短时间内达到常规组更长成熟时间的嫩化效果，这是由于超声的空化效应等使得鹅胸肉的肌原纤维结构完整性在短时间内遭到破坏，细胞膜的通透性改变，肌浆蛋白溶出，组织内的嫩化酶被释放，使鹅胸肉的嫩化效果显著高于常规组。随着放置时间的延长，超声组的剪切力值呈上升趋势，放置48 h时剪切力大小趋向常规组0 h，可能是超声处理对缩短鹅胸肉宰后僵直期、嫩化肌肉有显著效果。

2.6 鹅胸肉块肌动蛋白SDS-PAGE分析

图 6 鹅胸肉肌动蛋白的SDS-PAGE图（A）和定量分析图（B）Fig. 6 SDS-PAGE patterns (A) and quantity analysis (B) of actin content in goose breast meat

超声组和常规组在不同放置时间下MP的SDS-PAGE分析如图6所示，肌球蛋白为大分子蛋白质，分子质量为510 kDa，难以在电泳图中进行表征，而肌动蛋白分子质量为43 kDa，在电泳实验中可使用常规宽分子质量Marker进行参照，操作比较简单方便,因此多以肌动蛋白含量表征肌动球蛋白解离情况。图6A电泳图为肌动蛋白条带，通过定量分析（图6B）可知，常规组的肌动蛋白含量随着放置时间的延长逐渐减少，而超声组在放置12～48 h时游离态肌动蛋白含量逐渐增多，表明肌动球蛋白大量解离。这是由于宰后成熟过程中，肌肉先经历僵直期，肌动蛋白和肌球蛋白大量结合形成肌动球蛋白，使得肌动蛋白含量降低，肌肉嫩度下降。而在肌肉解僵期，肌动球蛋白大量解离形成肌动蛋白和肌球蛋白，肌动蛋白含量增加[26]。超声处理破坏了细胞结构，释放组织蛋白酶和钙蛋白酶，在酶体系的作用下，加速了肌动球蛋白降解，大量肌动蛋白形成，对嫩化肌肉、缩短宰后僵直期有显著效果，这也与剪切力及pH值等指标的结论相符。

2.7 鹅胸肉块超微结构的变化分析

通过SEM观察，与常规组相比，超声处理对鹅胸肉超微结构的影响如图7所示。由图7可以看出，超声组的SEM图可观察到鹅胸肉肌原纤维间明显的空隙、空洞和肌节。常规组随着放置时间的延长肌原纤维间隙不断增大，肌纤维由紧密排列逐渐变松散。超声组放置0 h的鹅胸肉肌纤维间隙较常规组放置24 h更明显，这可能是由于超声的空化效应使肌纤维之间出现空洞，孔隙增大，肌肉结构变松散，促进鹅胸肉嫩化，在放置48 h时超声组鹅胸肉肌纤维排列重新变紧密，这可能由于物理嫩化不能彻底改变肌肉蛋白的结构，放置一段时间后，肌动蛋白和肌球蛋白重新结合，肌节横向收缩，肌纤维结构逐渐复位。这也与上述指标的变化趋势相符。

2.8 鹅胸肉块热力学性质变化分析

图 8 鹅胸肉的DSC图Fig. 8 DSC thermogram of goose breast meat

如图8所示，热流曲线上出现了2 个峰，分别为峰I、峰II。Martens[27]、Dergez[28]、Palka[29]等的研究显示，峰I为肌球蛋白热变性引起的热流变化，峰II则由肌动蛋白热变性引起。

表 1 超声处理后不同放置时间的鹅胸肉的变性温度和变性焓Table 1 Thermal denaturation temperature and denaturation enthalpy of goose breast meat subjected ultrasonic treatment during different storage times

由表1可知，超声组热变性温度Tm（包括T1和T2）左移，代表肌球蛋白热变性温度的峰值T1和代表肌动蛋白热变性温度的峰值T2均较常规组低，焓变（ΔH1、ΔH2）亦呈减小的趋势。超声处理后鹅胸肉的两个峰值变性温度在0～24 h均低于常规组，表明超声处理对肌球蛋白和肌动蛋白的热稳定性具有显著影响，这也与史培磊等[30]的结果一致，可能是超声处理导致肌肉蛋白质的高级结构改变，空间立体性增加，构象的变化导致相变或者蛋白质间交联作用改变，促进了MP粗、细丝间的距离增大、MP骨架的降解等，这也与SDS-PAGE分析及SEM观察等结果相符。

3 结 论

本实验对未超声处理的常规组和超声组在4 ℃下放置不同时间鹅胸肉进行分析，结果表明超声处理可升高鹅胸肉pH值，缩短鹅胸肉成熟所需时间，显著减小蒸煮损失率和剪切力，致使肉品热敏性和表面微观结构发生明显变化，肌动蛋白含量显著增大（P＜0.05），从而改善鹅胸肉嫩度。但这仍需进一步实验证实，尤其是将超声与肌动球蛋白解离联系在一起并延长处理后的放置时间，以确定肌动球蛋白解离与超声嫩化之间的关系，这将有助于更清楚地了解鹅胸肉的宰后成熟机理，为进一步改善鹅肉品质提供理论依据。