共振散射光谱法测定牛奶中的四环素

唐宁莉，范晶晶，马小龙，王文平，单展

（1.桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林541004；2.桂林理工大学广西高校食品安全与检测重点实验室，广西桂林541004；3.桂林理工大学电磁化学功能物质广西区重点实验室，广西桂林541004）

四环素类抗生素是一种由链霉素产生的广谱抗生素。由于它可以预防和治疗传染病、提高饲料效率、加快动物的生长速度，所以在畜牧业中得到广泛应用。近年来，随着养殖业的快速发展，四环素主要作为一种兽药和饲料添加剂用于畜禽养殖业，其用量逐年增加。但是四环素不能完全被人和动物所吸收，大约摄入量的75%会通过尿液和粪便排泄出来[1]，未经适当预处理的四环素进入水环境和土壤中，容易造成环境问题，包括生态风险和抑制水生、陆生生物的生长。食品中残留的四环素会造成一些非致病菌的死亡，使菌群失调，抑制有益菌的生长，为一些致病菌提供生存空间[2]，对人类健康造成不良影响。随着社会的进步，人们对食品安全越来越重视，牛奶是所有年龄阶层的人们生活中不可或缺的营养品。但在奶牛的饲养过程中，四环素常用作饲料添加剂及防治奶牛的乳腺炎，从而导致牛奶中可能有四环素残留。因此，建立一种快速、灵敏地检测牛奶中痕量四环素的方法至关重要。目前，测定四环素的主要方法有微生物法[3-4]、免疫学快速检测法[5-7]、高效液相色谱法[8-12]、表面拉曼光谱法[13]、酶联免疫吸附法[14-15]、紫外-可见分光光度法[16-18]、荧光光度法[19-21]、电化学法[22-23]、共振散射法[24]等。

共振光散射的概念是1979年由Anglister等[25-26]提出并推导出了共振散射强度与被测物浓度的定量关系式。光散射是指当一束光通过介质时在入射光以外的方向上观测到光强的现象。当介质中的粒子直径远小于入射光波长时，会产生以Rayleigh（瑞利）散射为主的分子散射。当瑞利散射位于或接近它的吸收带时，由于分子吸收电磁波的频率与其散射频率相同，分子因共振而强烈吸收散射光的能量发生再次散射，其散射强度通常较单一的瑞利散射提高几个数量级，不再遵守散射强度与波长的四次方成正比的散射定律。这种吸收-再散射的过程称为共振瑞利散射，又叫共振散射。1993年，美国科学家Pastermack等使用荧光光度计获得了一种共振散射光谱，并首次将共振散射技术用于研究卟啉类化合物[27]。由于共振散射光谱法具有操作简便、快速、灵敏度高、选择性好、成本低等优点，近年来被广泛应用于检测金属离子、蛋白质、食品及小分子药物等。但是，目前利用共振散射光谱法检测四环素的研究较少。利用四环素分子中的β-二酮结构与Co2+形成二元阳离子，然后再与带负电的铝试剂通过静电引力作用形成三元离子缔合物，从而改变反应前后体系的共振散射强度，建立一种快速、简便地检测牛奶中四环素的共振散射光谱法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四环素标准溶液（tetracycline，Tc，90%）：美国Amresco公司；1.0×10-3mol/L的Tc储备液，由储备液稀释得到1.0×10-4mol/L的Tc工作液；Co2+溶液（由氯化钴配制成1.0×10-2mol/L）：上海试剂二厂；铝试剂溶液（aurin tricarboxylic acid，ATA，1.0×10-3mol/L）：新中化学厂；HCl、H2SO4、HAc（1.0×10-5mol/L）溶液：广东汕头市西陇化工股份有限公司。

试验所用试剂均为分析纯，用水均为二次去离子水。

1.2 仪器与设备

F-7000荧光光度计：日本津岛；pHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理[28]

准确量取5.0 mL牛奶样品（购买于当地某超市的蒙牛、伊利纯牛奶）于100 mL离心管中，加入50 mL pH 5.0的乙酸钠缓冲液-乙腈混合溶液（体积比1∶4），超声5 min，5 000 r/min离心20 min除去蛋白质。然后取上清液于分液漏斗中，加入25mL正己烷，超声5min，静置分层后弃去正己烷层。吸取下层清液，用正已烷反复脱脂至澄清，得样品待测液。

1.3.2 四环素浓度的测定

考虑到试验条件对测定结果有一定的影响，进行了反应介质及用量、氯化钴用量、铝试剂加入量、反应温度和反应时间几个单因素试验，选择最佳试验条件测定四环素浓度。

在10 mL的具塞比色管中，分别加入0.5 mL 1.0×10-5mol/L HCl溶液，1.5 mL 1.0×10-2mol/L Co2+溶液，2.0 mL 1.0×10-3mol/L ATA溶液和一定量的Tc工作液（以不加Tc的溶液为试剂空白），加水稀释至10 mL，摇匀，室温反应30 min后，在荧光光度计上以激发波长等于发射波长（λex=λem）的方式进行同步扫描，记录波长401.8 nm处有四环素标准溶液的共振散射强度I和试剂空白的共振散射强度I0，并计算共振散射强度差值ΔI=I-I0。

1.4 数据处理

数据分析及图形绘制采用origin软件处理。

2 结果与分析

2.1 体系的共振散射光谱

依照试验方法扫描了体系的共振散射光谱，结果如图1所示。

图1 体系的共振散射光谱Fig.1 Resonance light scattering spectra of the systems

在 HCl溶液中，Co2+、ATA、Tc的两两反应产物（图1曲线1～3）的共振散射强度都较弱，但当三者共存时，体系的共振散射强度随Tc浓度的增大而增强（图1曲线4和5），并且在401.8 nm处具有最强的共振散射峰，由此可见Co2+、ATA、Tc三者反应生成三元离子缔合物后使体系的共振散射强度增强。

2.2 试验条件的优化

2.2.1 反应介质及其用量

分别考察了 HCl、H2SO4、HAc 3种溶液对反应体系的影响（见图2）。

图2 不同介质对体系的影响Fig.2 Effect of different medium on system

由图2可知，体系在不同介质中的共振散射强度差值（ΔI）不同，在HCl溶液中体系的 ΔI值较大，且较为稳定，所以选择HCl溶液作为反应介质。向体系中加入不同体积的稀HCl溶液，结果表明：当HCl用量为0.1 mL～0.5 mL时，随HCl用量的增大，四环素与Co2+形成的螯合阳离子逐渐增多，该阳离子与带负电的铝试剂形成的三元离子缔合物也逐渐增多，因此ΔI逐渐增大；当HCl用量为0.5 mL时，反应基本完全，ΔI值最大，灵敏度最高，故选择1.0×10-5mol/L的HCl最佳用量为0.5 mL。

2.2.2 氯化钴用量

试验加入了不同体积的氯化钴溶液时体系的反应情况，结果见图3。

图3 氯化钴用量的影响Fig.3 Effect of the volume of Co2+

由图3可知，当Co2+的用量在0.6 mL～1.5 mL之间，ΔI值随Co2+用量的增加而增大，用量超过1.5 mL后，体系的ΔI值随着Co2+用量的增加而减小，为了保证四环素Tc与Co2+能充分反应，所以选择氯化钴用量为1.5 mL。

2.2.3 铝试剂用量

加入不同体积的铝试剂时，体系的△I值会有相应的变化，结果见图4。

图4 铝试剂用量的影响Fig.4 Effect of the volume of ATA

由图4可知，当1.0×10-3mol/L ATA的用量为1.5 mL～2.0 mL时，体系的ΔI值随铝试剂用量的增大而增大；当ATA的用量为2.0 mL～2.8 mL时，体系的ΔI值随铝试剂用量的增大而减小，故选择1.0×10-3mol/L ATA的用量为2.0 mL。

2.2.4 反应温度的选择

试验了不同反应温度对体系ΔI值的影响，结果见图5。

由图5可知，当反应温度在5℃～20℃时，随温度升高，体系的ΔI值逐渐增大；当反应温度为20℃～30℃时，体系的ΔI值变化不大；当继续升温后发现，随着温度的升高，体系的ΔI值不断下降。因此，为了方便操作，选择在25℃（即室温）下进行反应。

2.2.5 反应时间的选择

反应时间对体系△I值的变化也有一定的影响，结果见图6。

图5 反应温度的影响Fig.5 Effect of reaction temperature

图6 反应时间的影响Fig.6 Effect of reaction time

如图6所示，当体系反应时间在5 min～30 min时，体系的ΔI值随时间的延长而增大；当反应时间为30 min时，ΔI值达到最大；反应30 min后，体系的ΔI值略有降低，所以选择体系的反应时间为30 min。

2.3 工作曲线及方法的检出限

在最优试验条件下，测定不同浓度Tc标准溶液的I，并绘制对应ΔI值的标准曲线，结果见图7。

图7结果表明，Tc浓度在2.0×10-7mol/L～1.5×10-5mol/L范围内与体系的ΔI值存在良好的线性关系。线性回归方程为：ΔI=1.247×107c+16.44（c为 Tc的浓度，单位mol/L），相关系数为0.997 1。平行测定13次试剂空白，标准偏差（s）为0.20，计算出检出限为4.81×10-8mol/L（DL=3S/K，式中：DL 表示检出限，S 表示标准偏差，K表示线性回归方程的斜率）。

图7 Tc的标准曲线Fig.7 Calibration curve of Tc

2.4 共存物质的影响

在优化的反应条件下，考察了可能存在干扰的物质对1.0×10-5mol/L四环素（Tc）标准溶液测定的影响，当相对误差在±5%以内时，共存物质的允许量（以倍数计）如下：蔗糖（158）；葡萄糖（140）；NO3-（80）；Na+、K+（60）；EDTA、SO42-（50）；Mg2+、NH4+（30）；甘氨酸（20）；L-天冬氨酸（12）；DL-半胱氨酸、L-酪氨酸（9）；L-精氨酸（4.7）；Fe3+（1.7）；Fe2+（0.8）。

2.5 样品测定

取一定体积的样品待测液按照试验方法测定，均未检出四环素。为考察试验方法的可行性，做了加标回收试验，如表1所示。

表1 样品和回收率分析结果（n=5）Table 1 Analytical results of samples and recovery（n=5）

由表1可知本方法的加标回收率在99.28%～101.70%之间。

3 结论

在酸性条件下，四环素与Co2+形成的螯合阳离子与带负电的铝试剂通过静电引力形成三元离子缔合物，使体系在401.8 nm处的共振散射强度增强，且四环素浓度在2.0×10-7mol/L～1.5×10-5mol/L范围内与共振散射强度增加值存在良好的线性关系。通过优化体系的反应条件，建立了定量检测四环素的共振散射光谱法，方法的灵敏度较高，检出限为4.81×10-8mol/L，且操作简便、快速，可用于测定牛奶样品中四环素的残留量。