水产品中14种抗生素药物残留检测方法的建立

金钥，孙延斌，梅连瑞，李经纬

（1.天津市产品质量监督检测技术研究院，天津300308；2.天津津滨华测产品检测中心有限公司，天津300300）

近年来，水产品的消费呈逐年递增趋势[1]。兽药的滥用、误用、不遵守休药期等诸多问题，是导致水产品安全问题、引起贸易争端的主要原因[2]。本试验检测的大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类药物所针对水产品的最大残留限量（maximum residue limit，MRLs）并不完全，而目前国标针对于水产样品的前处理也存在一定的缺陷，具体的取样依据不够完善[3]；检测项目的筛查能力不足[4]。（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）[5-9]能满足兽药多残留的仪器检测要求，而前处理就成为兽药残留检测的关键步骤，（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe，QuEChERS）方法[10-14]用于兽药残留的前处理工作时，不仅保证前处理操作过程简便、耗时短、有良好的净化能力，还能保证方法的回收率、精密度。

因此，本研究通过QuEChERS结合UPLC-MS/MS建立同时测定水产品中14种兽药残留的检测方法，完善水产品兽药残留的监控体系，同时也为兽药残留分析提供方法依据，从而建立适合现代检测需求的快速、高效、绿色环保、成本低廉的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱串联四级杆质谱仪（AB Triple Quad 6500四级杆质谱仪）：美国AB公司；Agilent 1290超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；Wters BEH C18、Waters BEH HILIC色谱柱：美国Waters公司；Agilent Eclipse Plus C18RRHD色谱柱：美国安捷伦公司。

超纯水：屈臣氏；乙腈、甲醇（色谱纯）：德国默克公司；甲酸（ACS纯）：美国西格玛公司；C18填料、PSA 填料：天津博纳艾杰尔科技有限公司；醋酸、无水硫酸钠、无水硫酸镁、醋酸钠、氯化钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

标准物质（4-硝基咪唑、甲硝唑、地美硝唑、2-5-硝基咪唑、阿奇霉素、林可霉素、竹桃霉素、替米考星、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素、克拉霉素、罗红霉素、螺旋霉素，所有药物纯度均大于99%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司。

标准溶液的配制：准确称量标准品，乙腈定容，分别配制浓度范围在0.2 mg/mL～1 mg/mL之间的标准储备单标；标准中间储备液：将同一类药物的标准储备单标配制成一类药物的中间液，乙腈定容，配制成10 μg/mL中间液后再稀释成500 ng/mL中间液；混合标准工作液：用初始流动相对中间液进行稀释，稀释成所需浓度。标准溶液均为避光冷藏保存。

所需其他溶液：0.1%甲酸水溶液；0.1%甲酸-乙腈溶液；样品提取溶液（5%醋酸-乙腈溶液）；样品复溶液（初始流动相）。

1.2 样品前处理

鱼类取背脊部鱼肉进行破碎，贝类、虾类取可食用部分进行破碎，置于-18℃冰箱保存，称取解冻恢复至室温样品2 g（精确到0.1 mg）置于50 mL离心管内，加入1 mL内标工作液、2 mL超纯水，使样品充分分散，加入10 mL 5%醋酸乙腈，同时加入4 g Na2SO4和1 g NaCl混匀，5 000 r/min，离心 5 min；移取上清液置于另一装有150 mg C18、50 mg PSA（乙二胺-N-丙基填料，N-（N-propyl）ethylenediamine） 的 15 mL 离心管中，涡旋混匀使样品与填料充分接触，5 000 r/min离心5 min后移取6 mL上清液，上清液在35℃下氮吹至近干；用1 mL初始流动相复溶，过0.22 μm滤膜，待上机检测。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为 Waters BEH C18，1.7 μm，2.1mm×100 mm；流动相A为水、B为乙腈（均添加0.1%甲酸），洗脱程序见表1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

1.3.2 质谱条件

正离子模式扫描（ESI+）；多反应监测采集方式（MRM）；雾化气压力及辅助气压力均为4.14×105Pa；气帘气压力：2.07×105Pa；离子源温度：550℃；电喷雾电压：5 500 V；化合物的离子对参数、碰撞电压、去簇电压等参数见表2。

表2 14种化合物的质谱采集参数Table 2 Mass condition of 14 compounds

续表2 14种化合物的质谱采集参数Continue table 2 Mass condition of 14 compounds

图1 14种组分混合标准溶液的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of 14 analytes mixed standard solution

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

色谱条件的优化旨在待测物之间的有效分离及目标化合物与杂质之间的有效分离。色谱柱考虑了Waters BEH HILIC、Agilent Eclipse Plus C18RRHD 及Waters BEH C18色谱柱，结果显示，Waters BEH C18是本试验发现效果较好的柱子。

有机相通常选择甲醇、乙腈及甲醇与乙腈的混合物，乙腈与水混合对色谱柱能起到保护作用，而且乙腈有比甲醇强的洗脱能力，峰型好，柱效高等特点[15]，所以选择乙腈作为有机相；化合物发生电离时，需要一定的阳离子为其提供质子来源，结果显示，添加0.1%甲酸对化合物的分离效果最优，可以获得尖且高的峰型，选择分别在水相及有机相添加0.1%甲酸作为流动相。图1为QuEChERS结合UPLC-MS/MS建立的方法所得出的（multi-reaction monitoring mode，MRM）谱图。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化

由于乙腈的提取效果优于甲醇、乙酸乙酯，且乙腈不会提取出较多的基质杂质[16]，因此选取乙腈为QuEChERS的提取溶剂；试验中发现样品随着乙腈的加入而变的坚硬且成团，不利于待测化合物的提取，采用了先加水再用乙腈提取的方法；提取剂的酸度也需要优化，考虑了乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈分别作为提取剂，结果显示，5%醋酸乙腈为提取剂时，14种兽药的平均回收率获得了最优的结果。综合考虑，选择5%醋酸乙腈为本方法的提取溶剂，结果如图2。

图2 提取剂酸度的优化Fig.2 Effect of extraction solvent acidity

2.2.2 净化条件的优化

净化是去除提取溶液中杂质，利于后续的检测工作[17]。盐析的作用是去除蛋白质等基质杂质，常用的盐析剂有NaAc和NaCl，吸水剂有MgSO4和Na2SO4，结果见图3。

图3 盐析剂、吸水剂的选择Fig.3 Choice of salting-out and absorbing agent

NaCl和Na2SO4组合时，硝基咪唑类及林可胺类化合物的均为最高，大环内酯类为次高，最后选择NaCl和Na2SO4；QuEChERs技术是通过固相分散萃取技术对提取液进行净化，即需要对杂质有较强的吸附能力，而对目标化合物的吸附能力较弱，常用的吸附剂主要有PSA、C18、中性氧化铝，水产品中含有丰富的蛋白质、脂肪类物质，故本研究选取PSA、C18对水产品进行净化；本试验考虑了PSA、C18的不同使用量，结果如图4。

图4 吸附剂比例的优化Fig.4 Effect of adsorbent ratio

图4结果表明，使用50 mg PSA+150 mg C18组合时，样品溶液澄清，基质干扰较小，回收率显著。

2.3 基质效应评价

在UPLC-MS/MS分析中，基质效应一般认为是与目标化合物共流出的杂质对目标化合物离子化过程的影响[18]，但基质效应是很难完全消除的。试验最终采用基质匹配曲线来对样品中的兽药残留进行定量，以抵消基质效应影响。

2.4 方法学验证

2.4.1 基质曲线与检测限

以没有添加任何药物的鲫鱼为阴性样品。以信噪比S/N≥10为LOQ，信噪比S/N≥3为LOD，求得14种化合物的相关系数均大于0.99，检出限（limit of determination，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）分别在 0.01 μg/kg～0.13 μg/kg和 0.02 μg/kg～0.44 μg/kg 范围内，见表3。

表3 14种兽药的定量限、检出限、回归方程、线性系数、回收率与相对标准偏差Table 3 Limit of detection（LODs），limit of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 14 veterinary drugs

续表3 14种兽药的定量限、检出限、回归方程、线性系数、回收率与相对标准偏差Continue table 3 Limit of detection（LODs），limit of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 14 veterinary drugs

2.4.2 回收率与精密度

试验中选取1、2、5 μg/kg 3个浓度水平进行添加，每个浓度重复6次平行测定，14种兽药的回收情况为69.66%～97.25%，标准相对标准偏差为1.55%～10.06%，见表3。

2.5 实际样品检测

本试验水产品样品的采集依据SC/T 3016-2004《中华人民共和国水产行业标准》进行采样。样品主要为天津地区养殖水产品，样品包括淡水鱼斑点叉尾鮰、大鳞鲃、加州鲈鱼、鲤鱼、花鲢鱼、草鱼；海水鱼点带石斑鱼、珍珠龙胆石斑鱼、半滑舌鳎、大菱鲆；贝类为菲律宾蛤仔、毛蚶；虾类为南美白对虾。天津地区养殖水产品中14种兽药均未检出。

3 结论

本试验通过QuEChERs结合UPLC-MS/MS对14种兽药进行检测，采用5%醋酸乙腈提取，PSA、C18净化，水：乙腈（均含有0.1%甲酸）为流动相，Waters BEH C18，1.7 μm为色谱柱，建立了UPLC-MS/MS同时测定水产品中14种兽药残留的分析检测方法。本方法试验检测周期短、前处理方法简单，无需特殊实验装置，且试验成本低，为大批量水产品兽药残留检测提供了简便可靠的方法。