基于琼脂扩散法的抗菌肽定量测定方法优化

魏东东，刘杨柳，王志新，郭润芳，贾英民，于宏伟，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001；2.北京工商大学食品学院，北京100048；3.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是生物有机体在抵抗外源病原微生物时所产生的一种防御性肽类活性物质，也被称为肽类抗生素[1]（peptide antibiotics）。其来源广，分子量小，热稳定性高，不仅具有广谱的抗细菌活性，还对真菌、病毒和寄生虫有一定的活性[2-3]。目前已报道的抗菌肽多以阳离子型多肽为主，作用机理与抗生素不同[4]，对抗生素耐药菌株表现出较高的抑菌活性，不易产生耐药性[5]，有望成为抗生素的良好替代品，在医学临床[6]、食品防腐[7]、饲料添加剂[8]等领域均具有广阔应用前景。然而，抗菌肽在进入实际应用前尚无系统完备的安全评价体系和标准[5]，而作为安全评价中最基础的定量研究更是鲜有研究者涉足，致使抗菌肽定量测定方法不统一，相关研究不具备可比性。

目前，针对抗菌肽定量测定方面，国内外尚无明确统一的方法，大部分采用类似于抗生素定量测定的方法——微生物检定法和理化检定法[9]。如《中华人民共和国药典》所采用的方法为管碟法和浊度法。通过量反应平行原理，即同等剂量的待测品与生物标准品抑菌效果一致，进而对待测样品进行标定。应用时必须具备生物标准品，而抗菌肽因来源广、种类多、组分复杂生物标准品在制备和评价时有一定难度，且无法像抗生素那样使用重量进行效价标定。因此，这两种方法均未在实验室研究中得以推广。理化检定法，如高效液相色谱法和紫外分光光度法在实验室相关研究中也常用到。但是其测量结果不能直接反映抗菌肽的抑菌效能，因此短期内很难代替微生物检定法[10]。现阶段实验室普遍采用的是二倍稀释法，该法操作简便，但在确定最低抑菌浓度时，主要通过肉眼识别，人为因素给试验带来一定的误差[11]；本试验所采用的琼脂扩散法根据抗菌肽浓度对数值与抑菌圈直径之间存在线性关系来确定最低抑菌浓度，继而求得抗菌肽效价[12]，既解决了抗菌肽没有标准品的现状，又使用统计学方法避免了人为主观影响，所得结果更具有可信度。该种方法操作简单，成本较低，能够满足实验室的测定要求。琼脂扩散法中最主要的数据是抑菌圈的大小，其中菌种的生长活力、形态、培养时期、菌液浓度以及培养基的厚度、琼脂浓度都会对抑菌圈的大小、清晰度产生影响[13]。因此，对琼脂扩散法中的相关试验因子进行优化对提高测定结果的可信度具有重要意义。

本试验以硫酸多粘菌素B为例，以重复性和精密度为指标，对琼脂扩散法试验中所涉及的指示菌培养时期、浓度，培养基的琼脂浓度和厚度对琼脂扩散法的影响进行探讨并对各影响因素进行优化，确定抗菌肽定量测定的最佳试验条件。同时，采用杆菌肽和大肠杆菌进行重复验证试验，以期得到重复性好，精密度高，具有高度适用性的抗菌肽定量测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

硫酸多粘菌素B、杆菌肽：上海麦克林生化科技有限公司；琼脂培养基：北京索莱宝科技有限公司；营养肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；铜绿假单胞菌ATCC9027、大肠杆菌ATCC25922：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

牛津杯（内径6.0mm±0.1mm，外径8.0 mm±0.1 mm）：武汉药科新技术开发有限公司；一次性平板（90 mm×20 mm）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；游标卡尺：日本三丰（Mitutoyo）公司。

1.2 方法

1.2.1 铜绿假单胞菌生长曲线的测定

挑取铜绿假单胞菌单菌落，接种于5 mL营养肉汤培养基中，于37℃摇床中震荡培养12 h，作为生长曲线测定用种子液，取铜绿假单胞菌种子液，按照0.1%接种于100 mL营养肉汤培养基中，于37℃摇床中震荡培养。采用稀释涂布法进行菌落计数并测定OD值。

1.2.2 硫酸多粘菌素B标准液的制备

精确称取0.05g硫酸多粘菌素B，溶于500μL无菌磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）中[14]，使其浓度为100mg/mL震荡均匀分装于离心管中，于-20℃保存。使用时，将标准液用pH 6.0的无菌磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度。

1.2.3 抑菌试验

将按照生长曲线的方法培养铜绿假单胞菌，使用pH 6.0的磷酸盐缓冲液对菌液进行稀释，使菌液OD600至0.8，备用。

将灭菌的营养琼脂冷却至45℃～50℃，按照2%接种1.2.1中指示菌稀释液，混匀。等量分装至培养皿中，冷却后，等距离安放牛津杯。在牛津杯中加入50 μL不同稀释度的硫酸多粘菌素B稀释液，37℃培养箱中培养14 h～16 h，每个试验4个平行，重复3次。使用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个抑菌圈测量3次，并记录平均值。

测定方法的稳定性（即重复试验中斜率和截距的一致程度）以回归直线斜率和截距的相对标准偏差来判断。精密度（即在规定条件下，对同一或类似被测对象重复测量所得示值间的一致程度）用来验证在给定浓度范围内回归方程的有效性，以回归方程的回归系数来判断。

1.2.4 数据处理

以硫酸多粘菌素B浓度对数值为自变量，其所对应的抑菌圈直径为因变量，在Origin Professional 8.0软件中进行线性回归。并对斜率、截距、决定系数R2进行单因素方差分析，计算平均数、标准偏差以及相对标准偏差[15]。

1.2.5 效价定义

采用牛津杯琼脂扩散法，在规定的条件下，经抗菌肽浓度与抑菌圈直径所得线性方程计算所得抑菌圈直径为0时，所对应的抗菌肽质量为一个活力单位1AU。

式中：V为牛津杯中所加抗菌肽的体积，μL；X0为抗菌肽浓度对数值与抑菌圈直径所得线性方程的x轴截距。

2 结果与分析

2.1 铜绿假单孢菌生长曲线

铜绿假单孢菌生长曲线见图1。

图1 铜绿假单胞菌生长曲线Fig.1 Growth curves of Pseudomonas aeruginosa

由图1可知，铜绿假单孢菌在培养2 h以后，进入对数生长期；10 h时为对数末期；10 h以后进入稳定期，菌浓度为 8.5 lg（cfu/mL）。

2.2 抗菌肽浓度选择

Tramer J等在使用琼脂扩散法检测食品中乳酸链球菌素（Nisin）的含量时发现，一定浓度范围内Nisin浓度的对数值与抑菌圈直径之间存在线性关系[16-17]。为验证该种方法对硫酸多粘菌素B是否具有适用性，本研究采用不同浓度的硫酸多粘菌素B，进行抑菌试验（见图2），线性关系见图3。

图2 不同浓度硫酸多粘菌素B抑菌试验Fig.2 Different concentrations of polymyxin B sulfate antibacterial

图3 抗菌肽浓度对数值与抑菌圈直径间的线性关系Fig.3 Linear relationship between logarithm of antibacterial peptide concentration and diameter of zone of inhibition

结果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL浓度下，硫酸多粘菌素B浓度的对数值与抑菌圈直径之间线性关系良好（R2=0.991 8），因此选择 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的浓度作为硫酸多粘菌素B效价测定试验用的稀释浓度。

2.3 指示菌浓度

将硫酸多粘菌素 B 系列稀释液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）在不同指示菌浓度（104、105、106cfu/mL）的平板中进行扩散。指示菌浓度对斜率、截距及决定系数的影响见表1。

表1 指示菌浓度对斜率、截距及决定系数的影响Table 1 Effect of indicator concentration on slope，intercept and coefficient of determination

如表1所示，铜绿假单胞菌浓度为104cfu/mL与105和106cfu/mL相比，斜率有显著性差异（p<0.05），截距方面指示菌浓度106cfu/mL与104、105cfu/mL有显著性差异（p<0.05）。说明指示菌浓度对琼脂扩散法影响显著。当指示菌浓度为104cfu/mL时，其精密度较差（R2=0.988），斜率和截距的重复性相对较差。指示菌浓度为105、106cfu/mL时，其稳定性和精密度逐渐趋好，到106cfu/mL时达到最好。同时试验中还发现，当指示菌浓度较低时，抑菌圈边缘不清晰，存在颗粒感，易给测量带来较大误差。故选择铜绿假单胞菌浓度为106cfu/mL作为试验用最佳指示菌浓度。

2.4 培养基厚度

将0.2 mg/mL～1.0 mg/mL的硫酸多粘菌素B在不同厚度（1.57、2.36、3.15、3.93、4.72、5.50 mm）的培养基中进行扩散。所得结果如表2。

表2 培养基厚度对斜率、截距及决定系数的影响Table 2 Effect of medium thickness on slope，intercept and coefficient of determination

当培养基厚度大于3.15 mm时，对斜率和截距均没有显著性影响（p>0.05），且重复性和精密度均较差，推测当培养基体积较少时导致琼脂平板薄厚不均匀，不利于抗菌肽在琼脂中均匀扩散[16]。因此，进行扩散试验时要尽可能保证琼脂平板薄厚均匀，冷却时要避免放在坡度的平面上。故选择3.15 mm作为抑菌试验中培养基的厚度。

2.5 琼脂糖浓度

琼脂糖的添加量会影响硫酸多粘菌素B的扩散速率，当琼脂糖浓度过低，也会影响抑菌圈的清晰程度，在Nisin效价定量测定的试验中发现，当琼脂糖浓度为0.5%时，琼脂凝胶呈现水化现象[17]，故选择琼脂糖浓度为1.0%、1.5%、2.0%，进行试验。琼脂糖浓度对斜率、截距及决定系数的影响见表3。

表3 琼脂糖浓度对斜率、截距及决定系数的影响Table 3 Influence of agarose concentration on slope，intercept and coefficient of determination

由表3可知，在琼脂糖浓度1%～2%的范围内，其对斜率和截距的影响并不显著（p>0.05），但是当琼脂糖浓度为1.0%时，其精密度较差。当抗菌肽的扩散速率大于菌的生长速率时，易于形成模糊的抑菌圈[17]。试验中也发现，当琼脂糖浓度为1.0%时，所形成抑菌圈边缘模糊，测量结果误差大，这可能是导致上述结果出现的原因，故选择琼脂糖浓度为1.5%作为试验用最佳浓度。

2.6 指示菌的培养时期

根据铜绿假单胞菌生长曲线选择培养6、10、14 h的菌作为试验用指示菌，分别代表菌的对数期、对数末期和稳定期。不同生长时期对斜率、截距及决定系数的影响见表4。

如表4所示，铜绿假单胞菌的培养时期为对数期和对数末期时，其对斜率的影响并不显著（p>0.05），对截距的影响显著（p<0.05），对数末期之后，两者均没有显著性差异。据文献报道，大部分抗菌肽的作用机理与细菌细胞膜膜电位有关，而细胞膜膜电位在不同培养时期的变化情况不同[18-19]，给抑菌试验的重复性带来一定的影响。从重复性方面考虑，选择处于稳定时期（14 h）的铜绿假单胞菌作为指示菌的最佳培养时期。

表4 不同生长时期对斜率、截距及决定系数的影响Table 4 Effects of different growth periods on slope，intercept and coefficient of determination

2.7 试验验证

通过对抗菌肽定量试验进行优化，得出以铜绿假单胞菌为指示菌，确定试验的最优条件为：指示菌的最佳培养时期为稳定期，指示菌浓度为106cfu/mL，培养基厚度为3.15 mm（20 mL），琼脂浓度为1.5%，在此条件下所得硫酸多粘菌素B的效价为8 043 U/mg，95%置信区间（4 256，15 539）。为进一步验证试验的可行性，选用硫酸多粘菌素B、杆菌肽和指示菌大肠杆菌分别进行试验，结果见图4、图5、表5。

图4 硫酸多粘菌素B抑制大肠杆菌试验Fig.4 Inhibition to E.coli of polymyxin B

图5 杆菌肽抑制大肠杆菌试验Fig.5 Inhibition to E.coli of bacitracin

表5 试验验证Table 5 Test verification

试验的精密度和重复性较好，并且计算得杆菌肽对大肠杆菌的效价为304 U/mg，95%置信区间为（268，345），且3次重复所得结果p>0.05，差异不显著；硫酸多粘菌素B对大肠杆菌的效价为845 U/mg，95%置信区间（609，1172），3次重复所得结果 p>0.05，差异不显著。结果表明，利用该方法定量测定抗菌肽效价的重复性好，精确度高，具有较强的适用性。

3 结论

通过对琼脂扩散法进行优化，得出其测定抗菌肽效价的最佳条件为：指示菌的最佳培养时期为稳定期，浓度 106cfu/mL，培养基厚度 3.15 mm（20 mL），琼脂浓度1.5%。使用铜绿假单胞菌进行试验，所得结果稳定性较高。通过对上述因素进行分析，指示菌菌龄、琼脂糖的厚度对试验有较大的影响，其斜率和截距的变异系数高，在进行试验时需要严格控制。

药典中采用管碟法对抗菌肽效价进行测定时必须具备生物标准品，而抗菌肽因组分不单一，在生物标准品制备和效价定义方面存在一系列的问题，应用本试验方法解决了抗菌肽因没有标准品而测定方法不统一的问题。同时，药典中的管蝶法为两孔法，由于所采用的不同抗菌肽浓度的数值变异度小，致使结果稳定性差。通过对本试验最优条件下的试验数据采用药典的方法进行处理，发现其斜率变异系数为4.4%，截距的变异系数为0.62%。此外，药典中并未对影响试验的琼脂浓度、厚度，指示菌菌龄、接菌量进行控制[20]，因此理论上其对斜率和截距的变异系数更大。

该种测定方法使用成本低、试验操作简单，可以应用在抗菌肽的相关研究领域，如企业生产、实验室研究。通过不同抗菌肽的重复试验也发现，该种方法具有一定的普适性，且重复性良好，为抗菌肽的进一步应用奠定基础。当然对于抗菌肽效价的测定只是抗菌肽应用过程中亟需解决的关键问题之一，还有很多问题需要进一步试验去了解。