植物中花青素含量测定及种类分布研究

彭祖茂，邓梦雅，严虞虞，朱丽，张协光

（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518131）

花青素（anthocyanidin）属黄酮类化合物，又称花色素，是广泛存在于植物中的水溶性天然色素。据统计27个科，73个属的500多种植物含有花青素[1]，以葡萄皮、蓝莓、黑枸杞等含量最为丰富[2-11]。花青素因其资源丰富和安全无毒，同时拥有一定的营养和药用价值，在食品，医药、化妆品等方面拥有较大的发展市场。自然界中现已知的花青素有20多种，主要有天竺葵、矢车菊素、飞燕草素、甲基花青素、牵牛花色素和锦葵色素6种。自然界中花青素少以游离态的形式出现，常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖等通过糖苷键形成花色苷，已被发现天然存在的花色苷有250多种，可从不同植物中提取获得。花青素营养价值高，研究者们试图寻找花青素含量丰富的植物原料，从中提取花青素并投入到商业生产，开拓花青素应用市场。已投入商业生产的有葡萄皮色素，浆果类（草莓、杨梅、枸杞、蓝莓），紫薯等。

为实现花青素质量控制，需要采用合适的方法对其进行检测。花青素常用检测方法有紫外分光光度法，高效液相色谱法和高效液相色谱法/质谱联用法。紫外分光光度法常用于花青素总量的检测，往往受pH值、温度等外在条件影响，同时也会受原花青素、花白素等物质的干扰，分析结果往往偏高，灵敏度低。高效液相色谱法适用于分析样品中不同种类花青素的含量，相对高效液相色谱联用质谱成本低，需要标物才能定性样品。高效液相色谱联用质谱法常用于样品中花青素种类的全分析，获取信息更全[12-14]。花青素的检测根据检测目标物不同，可以分为检测花色苷和检测花青素母核。自然界中花色苷存在形式繁多。例如，黑枸杞[15]中花青素存在有飞燕草素-3-O-葡萄糖苷，矮牵牛素-5-O-葡萄糖苷，矮牵牛素-3-O-6-O-对香豆酰）芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷，锦葵色素-3-O-6-O-对香豆酰-3-O-乙酰）-5-O-二葡萄糖苷，飞燕草-3-O-6-O-乙酰）葡萄糖苷，锦葵色素-3-O-6-O-对香豆酰）葡萄糖苷和锦葵色素-3-5-二葡萄糖苷等；巨峰葡萄中含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，锦葵色素-3-O-葡萄糖苷，锦葵色素香豆素葡萄糖苷，矢车菊素乙酰葡萄糖苷，甲基矢车菊素乙酰葡萄糖苷，锦葵色素乙酰葡萄糖苷，甲基矢车菊素香豆素葡萄糖苷，甲基矢车菊素葡萄糖苷等形式花色苷。不同样品中花色苷形式不同，加之标准物质昂贵，有些甚至根本没有标准物质，因此检测花色苷存在一定困难；由于自然界中花青素的母核主要有6种，选取合适试验试剂，采用适当的方法将样品中花色苷水解成花青素单体后，便能实现不同种样品中花青素的统一检测，解决了因花色苷标物购买难而导致花青素检测困难的问题，是一种简单可行的方法。

本文选取黑枸杞、紫薯、蓝莓、沙棘、玫瑰王、山楂、樱桃、黑桑葚、青提、黑葡萄、红提、巨峰葡萄、金银花、贡菊、菊花、胎菊和野菊花等17种不同植物含花青素高的部位，包括根，茎或花。参照“NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》，用酸性无水乙醇溶液从不同植物中提取花青素，通过高效液相色谱法准确定量其中主要花青素的含量。旨在通过对不同植物中花青素含量的研究，指导企业及相关机构实现花青素的质量控制，为开拓花青素应用市场奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

黑枸杞、紫薯、蓝莓、沙棘、玫瑰王、山楂、樱桃、黑桑葚、青提、黑葡萄、红提、巨峰葡萄、金银花、贡菊、菊花、胎菊、野菊花：超市。

1.1.2 试剂

无水乙醇、甲酸、甲醇（均为色谱纯）：德国默克股份两合公司；盐酸（优级纯）：上海凌峰化学试剂有限公司；无水乙醇+水+盐酸（2∶1∶1，体积比）。

1.1.3 标物

飞燕草色素（Delphinidin，Dp，94.7%），矢车菊色素（Cyanidin，Cy，95%），矮牵牛色素（Petunidin，Pt，94.1%），天竺葵色素（Pelargonidin，Pg，93%），芍药色素（Peonidin，Pn，97.6%）和锦葵色素（Malvidin，Mv，94.8%），均为盐酸盐形式：Sigma-Aldrich。

1.2 仪器与设备

BSA323S-CW电子天平：赛多利斯公司；Agilent 1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；SK2510LHC超声提取仪：上海科导超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素提取

参照NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》样品前处理方法，准确称取0.5 g～2 g样品于50 mL具塞比色管中，加入无水乙醇+水+盐酸（2∶1∶1，体积比）定容至刻度，摇匀，超声提取30 min后，于沸水浴中水解1 h，取出后冷却，用无水乙醇+水+盐酸（2∶1∶1，体积比）定容。静置，取上清液，用0.45 μm水相滤膜过滤，待测。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，2.5 μm），流动相：A，1%甲酸水溶液；B，1%甲酸乙腈溶液；流速0.8 mL/min；梯度洗脱，0～2.0 min流动相B从8.0%～12.0%；5 min，18%B；10.0 min，20%B；12 min，25%B；15 min，30%B；18 min，45%B；20 min，80%B；22 min～30 min，8%B；检测波长：530 nm；柱温：35 ℃。

1.3.3 水分测定

参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》。

2 结果与分析

2.1 不同植物样品中花青素含量的测定

花青素的结构母核是2-苯基苯并吡喃阳离子（如图1）[16]。

图1 花青素结构式Fig.1 Structural formula of anthocyanin

由于R1、R2取代基团不同，导致6种花青素在色谱柱上保留时间不同而实现分离，6种花青素出峰顺序如图2所示。

图2 6种花青素标液的高效液相色谱图Fig.2 Chromatogram of six anthocyanins in standard

采用高效液相色谱配备二极管阵列检测器，在530 nm测得植物中6种花青素紫外吸收，样品中花青素谱图如图3所示。

图3 样品中花青素色谱图Fig.3 Chromatogram of anthocyanins in sample

表1 6种花青素线性方程及相关系数Table 1 The linear equation and regression coefficient of six different anthocyanins

表2 不同植物中花青素的含量Table 2 Anthocyanin content in different plants以干基计，mg/kg

根据浓度和峰面积做标准曲线（6种花青素线性方程及相关系数如表1所示），求得各样品中花青素的准确含量，结果以干基计，结果见表2。

如表1所示，采用液相色谱分析6种花青素，其相关系数（r）均≥0.999 8。表明液相色谱法可用于样品中6种花青素含量检测。从表2结果发现，6种花青素在不同植物体中的分布不同，其含量差异大。6种花青素在样品中的最高检出分别为：飞燕草色素596 mg/kg；矢车菊色素1 025 mg/kg；矮牵牛素4 671 mg/kg；天竺葵色素21 mg/kg；芍药色素1 005 mg/kg；锦葵色素1 000 mg/kg。其中矢车菊色素在植物中分布最广，这也是现行紫外分光光度法采用矢车菊色素作为标物，来测定样品中花青素含量的主要原因；其次，天竺葵色素分布最少，仅玫瑰王和黑桑葚中有检出。飞燕草色素主要存在于黑枸杞，蓝莓，沙棘和黑葡萄中；除黑枸杞和菊花类物质外，其余样品中均含有矢车菊素，以蓝莓中含量最高；矮牵牛色素在黑枸杞，蓝莓和黑葡萄中均有检出，且黑枸杞中含量最高。天竺葵色素不仅在植物界分布少，且其在植物中含量还很低；芍药色素是仅次于矢车菊色素分布较广的色素，尤以玫瑰王中检出最高；锦葵色素在黑枸杞、蓝莓、黑葡萄、巨峰葡萄中均有检出，其中蓝莓中含量最高。

为了更加清晰地了解不同植物中花青素的分布，不同样品中花青素分布见图4。

图4可以发现，黑枸杞中花青素含量高，蓝莓次之，菊花类产品中均未检出任何种类花青素，有研究表明，菊花中主要含黄酮类、黄酮醇类等物质[17-19]，有较强抗氧化自由基活性以及抗菌及抗病毒活性，是菊花类植物体内重要的抗氧化活性物质。此外，还发现蓝莓和黑葡萄中花青素在所检植物中种类较为齐全，均含有飞燕草色素，矢车菊色素，矮牵牛色素，芍药色素和锦葵色素。结果表明，蓝莓和黑葡萄是花青素摄入的最佳选择。在所检样品中还发现，金银花中含有75 mg/kg矢车菊色素。金银花和菊花皆是植物饮料的主要原料，由此可以推断，金银花可作为植物饮料中花青素的重要来源之一。

图4 不同样品中花青素分布Fig.4 Anthocyanin distribution in different samples

图5 17种样品系统聚类分析后谱系图Fig.5 The pedigree chart of 17 samples after cluster analysis

2.2 不同植物样品中花青素聚类分析

以花青素含量为指标，采用系统聚类分析法对17种样品进行聚类分析，得到结果如图5所示。

从图5中发现，聚类分析结果与样品中花青素总量分布有相似趋势，除黑枸杞，蓝莓和玫瑰王外，剩下样品可分为一类，共计4类。花青素在植物样品中分布可大致为黑枸杞，蓝莓，玫瑰王及其他。对其分组情况进行判别，得到全部组散点图，如图6所示。

从图6中发现，除黑枸杞，蓝莓和沙棘外，其他样品的质心均较为集中。黑枸杞和沙棘较蓝莓又更为离散，可能是因为黑枸杞中含有高含量矮牵牛色素，而其他样品中矮牵牛色素含量较低，甚至没有；沙棘中花青素主要为飞燕草色素，也是其他样品中含量较少的一种花青素。不同植物样品中花青素的聚类分析，有利于对可能含花青素样品的了解，为企业选料，原料溯源等提供技术支持。

图6 17种样品系统判别函数全部组散点图Fig.6 All group scatter plot of 17 kinds of samples system discriminant function

3 结论

通过高效液相色谱法分析得到不同样品中花青素的分布；同时，以花青素为变量对不同样品中花青素聚类分析后，结果表明：矢车菊色素在植物中分布最广，天竺葵色素分布最少，蓝莓和黑葡萄是花青素摄入的最佳选择，金银花可作为植物饮料中花青素的重要来源。自然界中花青素样品除黑枸杞，蓝莓，玫瑰王外，其他样品中花青素分布相似，含量并不高。因此，黑枸杞，蓝莓和玫瑰王可作为花青素主要原料来源。