AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附工艺的研究

（南阳理工学院生化学院，河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳473004）

艾草（Artemisia argyi），又称香艾，为菊科草本植物，适宜生长在温带地区，我国大部分地区均有生长，主要产于山东、安徽、河北、河南、湖北等省[1-5]。近年研究发现，艾草中含有的黄酮类化合物，具有降血脂、降血压、抗血栓、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、延缓衰老以及治疗慢性前列腺炎等多种生理活性。艾草作为黄酮类化合物的天然载体，具有广阔的开发应用前景[6-13]。

AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附的因素与吸附率之间的关系具有非线性特征。利用反向传播（back propagation，BP）神经网络可对非线性数据进行有效的分析处理，使非线性关系的输入量与输出量具有关联性，但在实际应用中存在网络全局搜索能力不足、易陷入局部最优等缺陷[14-17]。遗传算法是一种概率搜索算法，它的基本思想是通过全面模拟自然选择和遗传机制，通过对种群个体的选择、杂交和变异，形成一种具有“生产+检验”特征的搜索算法，该法具有全局最优的特点，且能优化BP神经网络的连接权值，可很好地克服BP神经网络陷入局部最优的缺陷，从而对形式未知的函数求出最优解[18-22]。

本文在单因素试验基础上，利用Box-Behnken试验的数据，采用BP神经网络建立AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附过程的数学模型，利用遗传算法对所建立的BP神经网络进行全局寻优，根据实际操作情况，将遗传算法全局寻优结果进行适当修正，确定AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附的最优工艺，以期为艾草黄酮进一步的生理活性研究奠定基础。

1 材料

1.1 原料

艾草：南阳市张仲景药材市场，清洗，晾干，粉碎，备用。

1.2 试剂

芦丁：中国药品生物制品检定所；氯仿、正丁醇、乙醇：天津科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠、盐酸、硝酸铝、亚硝酸钠：国药集团化学试剂有限公司。以上试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器设备

FW-100高速万能粉碎机、101-2A电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；FA1004精密电子分析天平：上海天平仪器厂；R-205旋转蒸发仪：无锡申科仪器有限公司；PHS-3C精密pH计、752N紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TDL-40B台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限公司；HWS-24电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；300 mm×16 mm层析柱：上海摩速科学器材有限公司。

2 方法

2.1 艾草黄酮粗提液的制备

准确称取20 g艾草粉置于1 000 mL三角瓶中，按照料液比1∶25（g/mL）的比例加入70%乙醇，置于60℃、120 r/min的恒温水浴振荡器内恒温振荡2 h，抽滤，滤液进行真空浓缩，至没有醇味。

2.2 Sevage法脱蛋白

量取适量艾草黄酮浓缩液于分液漏斗中，加入等体积的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇体积比为5∶1）剧烈振荡20 min，静置，去除蛋白层和有机溶剂层，取上清夜，反复多次操作，脱蛋白后的浓缩液置于-4℃冰箱中保存备用。

2.3 黄酮类化合物的测定

黄酮类化合物在亚硝酸盐作用下，与Al（NO3）3发生络合反应生成黄色铝络合物，在碱性条件下显红色，507 nm波长下有最大吸收[23]，因此可采用NaNO2-Al（NO3）3显色法，以芦丁作为标准品制作标准曲线，以507 nm作为检测波长测定吸光值，对比芦丁标准曲线，计算黄酮含量。

2.4 芦丁标准曲线的绘制

精确称取经105℃烘干的芦丁标准品15 mg，用80%乙醇溶解，配制成0.15 mg/mL的芦丁标准液100 mL，精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 的芦丁标准液于7个洁净的25mL容量瓶中，分别加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL 的 80%乙醇，然后再分别加入5%NaNO2溶液1.0 mL，充分振荡后静置6 min，再分别加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，充分振荡后静置6 min，向每个容量瓶内加入10%NaOH溶液10.0mL，最后用80%乙醇定容，充分振荡后静置15 min，在507 nm处测吸光值[24]。

2.5 单因素试验

2.5.1 上柱液浓度对吸附率的影响

配制不同浓度的艾草黄酮上柱液100 mL，其浓度分别为 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，pH5.0，以 0.8 mL/min的流速上柱进行动态吸附，分步收集流出液（5 mL/管），以流出液的颜色为参考，上柱液达到泄露点时，停止上柱，计算吸附率。

2.5.2 上柱液流速对吸附率的影响

配制0.6 mg/mL的艾草黄酮上柱液100 mL，调节酸碱性使其 pH5.0，分别以 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL/min的流速上柱进行动态吸附，分步收集流出液（5 mL/管），以流出液的颜色为参考，上柱液达到泄露点时，停止上柱，计算吸附率。

2.5.3 上柱液pH值对吸附率的影响

配制0.6 mg/mL艾草黄酮上柱液100 mL，分别调节pH 值为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，调节流速为 0.8 mL/min，收集流出的溶液（5 mL/管），以流出液的颜色为参考，上柱液达到泄露点时，停止上柱，计算吸附率。

2.6 Box-Behnken试验设计

根据单因素试验结果，以上柱液浓度、流速、pH值3个因素为自变量，以吸附率为响应值，采用Box-Behnken试验设计，进行三因素三水平的Box-Behnken试验设计[25-26]，因素水平表如表1所示。

表1 Box-Behnken试验设计的因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

2.7 BP神经网络模型建立

随机选择Box-Behnken试验设计的12组试验数据作为BP神经网络的学习及训练样本，其他3组试验数据用来检验所建立的神经网络的泛化能力，根据Box-Behnken试验的因素个数以及需要进行优化的指标的个数，设计BP神经网络的结构[27]，选择收敛精度10-3。

2.8 遗传算法优化

利用遗传算法对BP神经网络模型进行全局寻优，以神经网络的输出值作为求解的目标函数值，以Box-Behnken试验设计的数据作为初始种群，种群规模12，交叉概率0.05，变异概率0.01[28]。

2.9 吸附率的计算

式中：V0为上柱液体积，mL；C0为起始浓度，mg/mL；Vr为流出液体积，mL；Cr为过柱液浓度，mg/mL。

3 结果与讨论

3.1 芦丁标准曲线的绘制结果

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

以芦丁含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得一元线性回归方程为：y=0.339 5x+0.007 8，R2=0.997 5

3.2 单因素试验结果

3.2.1 上柱液浓度对吸附率的影响

上柱液浓度对吸附率的影响见图2。

图2 上柱液浓度对吸附率的影响Fig.2 The effect of upper column concentration on adsorption rate

由图2可知，吸附率随上柱液黄酮质量浓度的增大而逐渐增大，当浓度大于1.0 mg/mL时吸附率出现下降趋势，可能是由于大孔树脂的吸附能力是有限的，当树脂吸附达到饱和状态时，随着上柱液浓度的增加吸附率变化不明显[29]。

3.2.2 上柱液流速对吸附率的影响

上柱液流速对吸附率的影响见图3。

图3 上柱液流速对吸附率的影响Fig.3 The effect of flow velocity of upper column fluid on adsorption rate

由图3可知，随上柱液流速的增加，大孔树脂对艾草黄酮的吸附率逐渐增大，当上柱液流速大于0.8 mg/mL时，上柱液流速越大，树脂对黄酮的吸附率越低，可能是上柱液流速过大时，黄酮类化合物未被树脂充分吸附[30]。

3.2.3 上柱液pH值对吸附率的影响

上柱液pH值对吸附率的影响见图4。

图4 上柱液pH值对吸附率的影响Fig.4 The effect of upper column pH on adsorption rate

由图4可知，上柱液pH值对吸附率的影响较大，当上柱液pH值小于5.0时，吸附率相对较高，可能是黄酮类化合物含有酸性基团，在酸性条件下更易被大孔树脂吸附，当pH>5.0时，随pH值的增大，吸附率明显下降[29]。

3.3 BP神经网络模型建立

Box-Behnken试验结果见表2。

表2 Box-Behnken试验结果Table 2 The results of Box-Behnken experiment

图5 BP神经网络训练过程Fig.5 The training process of BP neural network

根据Box-Behnken试验的结果，采用BP神经网络建立AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附过程的数学模型，BP神经网络的学习及训练过程如图5所示。

由图5可知，随训练次数增多，BP神经网络的训练误差平方和逐渐减小，经4 923次训练，神经网络收敛，收敛精度达10-3，说明所建立的神经网络模型逼近能力较强[31]，可模拟AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附过程。

3.4 遗传算法优化结果

利用遗传算法对所建立的BP神经网络进行全局寻优，寻优过程如图6所示。

图6 遗传算法寻优过程Fig.6 The optimizing computation process of genetic algorithm

经过100代遗传进化，遗传算法全局寻优的结果为：上柱液浓度1.190 1 mg/mL，流速0.407 6 mL/min，pH4.682 6；最佳的目标函数值即最优适应度（AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附率）为90.419 2%。为便于实际操作，将遗传算法全局寻优的结果适当修正为：上柱液浓度 1.2 mg/mL，流速 0.4 mL/min，pH4.68。

3.5 最优提取工艺的验证试验

根据单因素试验结果，并与遗传算法全局寻优修正后的结果相结合，确定AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附的最优工艺为：上柱液浓度1.2 mg/mL，流速0.4 mL/min，pH4.68。在此条件下进行3次验证试验，结果取平均值，在此条件下AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附率可达90.28%。4 结论

1）结合单因素试验结果，利用Box-Behnken试验数据，采用BP神经网络建立AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附过程的数学模型，经4 923次学习及迭代训练，神经网络模型收敛，收敛精度达10-3，说明所建立的神经网络逼近输入与输出特性的能力比较强，可将其应用于AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附工艺的优化。

2）利用遗传算法对所建立的BP神经网络进行全局寻优，结合实际条件，将遗传算法全局寻优结果及单因素试验结果相结合，确定AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附最优工艺为：上柱液浓度1.2 mg/mL，流速0.4 mL/min，pH4.68。根据此条件进行3次验证试验，并取平均值，吸附率可达90.28%。

综上，将单因素试验、Box-Behnken试验、BP神经网络、遗传算法相结合优化AB-8大孔树脂对艾草黄酮动态吸附工艺是可行的，也为其他中药材中黄酮类化合物的分离纯化研究提供了有益参考。