不同品系成年小鼠乳腺干细胞差异分析

尹晓莹，高慧，孙晓伟，黄长江*

(温州医科大学 a 公共卫生与管理学院，b 检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035)

乳腺是一个动态变化的器官，在青春期、月经周期、怀孕、哺乳和绝经等过程中，组织结构和形态会发生很大变化。乳腺中存在着严格的等级结构，正常的乳腺上皮细胞可以根据细胞的特性和在导管中的位置分为组成导管内侧面的管腔上皮细胞和组成导管外侧面与基底膜相邻的基底细胞[1]。干细胞是一类具有自我更新复制及多项分化潜能的细胞，处于乳腺细胞等级的最顶级。祖细胞往往具有某种特定的细胞分化潜能但失去了自我更新能力，能够分化形成1种或几种低等级细胞。乳腺上皮细胞的这种多层次结构可以大大减少干细胞及祖细胞为维持乳腺组织的周期性变化而产生的消耗。乳腺是一个高度再生的器官，可以通过乳腺干细胞来调控乳腺增生、泌乳和复旧等周期性变化[2]。乳腺干细胞作为调控乳腺发育的重要部分，是乳腺癌细胞起源研究的焦点。自Dontu等[3]研究发现在人乳腺中存在一小群具有自我更新和分化能力的细胞之后，乳腺干细胞开始逐渐进入人们的视野。

长久以来，人们一直在寻找确定干细胞的方法，目前已有一些分子作为干细胞的标志物，但其特异性还有待研究[4]。3D细胞培养又称三维细胞培养，指在细胞生长过程中提供一个接近体内生存条件的微环境，使细胞处于更加接近人体或者动物体内环境中生长[5]，一般用来验证干细胞的自我更新和分化能力。本试验用乳腺干细胞富集的标志物筛选乳腺干细胞，后用3D细胞培养来验证乳腺干细胞的功能。

据2011年全球癌症统计报道，在女性中发病率和死亡率高居首位的是乳腺癌[6]，而与之相关的乳腺形态结构变化以及乳腺干细胞组成功能差异则成为了研究的热点[7-9]。实验小鼠由于生产繁殖快，成本低，易观察，平行性好且基因组与人类基因组有较高同源性，被广泛用作乳腺癌的模式生物。

目前已培育出的实验小鼠品系有很多，且各有特点。C57BL/6和Balb/c小鼠是应用较广泛的2个近交系小鼠，ICR小鼠是国际通用的封闭群小鼠，但在乳腺方面比较小鼠品系的差异尤其是比较不同品系小鼠的乳腺干细胞比例等方面差异的研究还比较少。本研究选择以C57BL/6、Balb/c以及ICR小鼠为实验动物，研究不同品系小鼠乳腺形态和乳腺干细胞组成方面的差异，从而为乳腺干细胞3D培养的浓度选择提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

成年C57BL/6、Balb/c，以及ICR小鼠(3～5月龄)购自北京维通利华技术有限公司，在动物房SPF洁净条件下饲养。整个实验过程严格按照学校动物管理中心实验动物规则进行饲养。乳腺组织采集以及后续无菌操作均在生物安全柜中进行。

1.1.2 实验仪器

二氧化碳培养箱和生物安全柜购自美国Thermo公司；光学显微镜购自日本尼康公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.1.3 试剂耗材

胭脂红和硫酸钾铝购自美国Sigma公司；Epicult-B基础培养基、Epicult-B Proliferation Supplement、Mammocult 基础培养基、Mammocult Proliferation supplement和乳腺上皮细胞富集试剂盒、氯化铵溶液、Trypsin-EDTA (0.25%)、DNase I、Dispase/抗鼠CD24-FITC抗体和抗人/鼠CD49f-PE购自加拿大Stem Cell公司；Streptavidin-APC抗体购自美国Invitrogen公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；基底膜基质购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺组织采集

小鼠用异氟烷麻醉后，颈椎脱臼处死。将处死的小鼠用70%酒精消毒后，在生物安全柜中腹部向上固定，用外用手术刀剪开外皮，用内用手术剪刀取下腹股沟处和胸腺处乳腺，备用。

1.2.2 小鼠乳腺整体染色

采集到的乳腺放在载玻片上摊平后放入配置好的染色固定液中，用胭脂红染液染色过夜，脱水封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.3 细胞流式分选

将采集到的乳腺放到消化液后在37 ℃、5% CO2培养箱中消化，依次加入氯化铵、胰蛋白酶和Dnase Ⅰ处理，得到单细胞悬液。分别加入不同荧光素标记的cocktail、Streptavidin-APC、CD24-FITC、CD49f-PE抗体，分选得到基底干细胞群(Lin-CD24+CD49fhi)和管腔干细胞群(Lin-CD24hiCD49flo)。

1.2.4 3D细胞培养

将流式分选得到的不同细胞群按照不同的浓度重悬于基底膜基质中，接种于12孔板中，待胶凝固后加入含有血清的培养基，8～9 d补加相同培养基，15 d后观察并记录3D结构的形态和大小。

1.3 数据统计分析

采用Graphpad Prism 6软件对数据进行方差分析，测定结果以平均值±标准差表示。*，**，***分别表示在5%、1%、0.1%水平上差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳腺形态的差异

如图1所示，C57BL/6和Balb/c小鼠乳腺具有完整清晰的二级和三级分支结构，但ICR小鼠二级结构和三级结构异常，且淋巴结面积增大。

图1 不同品系小鼠乳腺形态差异(1 000×)

2.2 乳腺干细胞组成的差异

对采集的小鼠乳腺组织进行消化，借助于不同的细胞表面抗原(CD24和CD49f)[10]，经流式细胞仪分选后得到2个细胞亚群，分别为基底干细胞富集的群(Lin-CD24+CD49fhi)和管腔干细胞富集的群(Lin-CD24hiCD49flo)。由图2可以看出，3个品系小鼠管腔干细胞所占比例以及管腔干细胞和基底干细胞的比均无显著差异，但ICR小鼠基底干细胞所占比例增加。

2.3 3D形成率的差异

流式分选出的细胞按照不用的浓度接种于基底膜基质中可形成3D结构，统计每1 000个细胞形成的3D数(图3)。研究发现，不管是基底干细胞还是管腔干细胞，Balb/c小鼠的3D形成率均显著高于另外两个品系小鼠。

2.4 3D直径和形态的差异

基底干细胞形成的3D多为实心结构，管腔干细胞形成的3D多为空心结构[11]。对形成的3D直径进行测量，同时记录空心以及实心结构所占比例(图4)。结果显示，Balb/c小鼠形成的3D直径以及结构与另外2个品系都有差异。

图2 不同品系小鼠乳腺干细胞组成差异

图3 不同品系小鼠乳腺干细胞3D形成率差异

图4 不同品系小鼠乳腺干细胞3D直径及形态差异

3 讨论

实验小鼠广泛应用于生命科学、医学、心理学等领域[12-13]，目前已育成1 000多种近交系和独立的远交群，可根据不同需要选择不同品系小鼠。C57BL/6小鼠属于近交系，是第一种拥有全基因组测序的小鼠，具有乳腺肿瘤和卵巢瘤自然发生率低且化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤等特点，经常被用来进行肿瘤学、生理学、免疫学等方面的研究。Balb/c小鼠的遗传背景为近交系，由亲兄弟姐妹遗传繁殖，因而遗传基因更纯，乳腺肿瘤自然发生率低，但用乳腺肿瘤病毒诱发时发病率高[14]，卵巢、肾上腺和肺部的肿瘤在该小鼠有一定的发生率。ICR小鼠属于远亲杂交群，具有繁殖力好，对疾病的抵抗力强的特点，主要被用于安全评价、药理学、毒理学和感染免疫等试验中。

在使用诱癌剂来建立诱发性乳腺癌动物模型的研究中发现，乳腺癌的发生是通过乳腺导管上皮细胞增生、非典型性增生、癌变，进而演变成为乳腺癌的动态过程进行的[15-16]。乳腺导管结构异常可能是乳腺组织发生病变的参考因素之一。通过乳腺整体染色，结果发现C57BL/6和Balb/c小鼠乳腺导管形态没有差异，但ICR小鼠乳腺导管形态异常，没有明显的二级和三级结构，且淋巴结面积增大，表明ICR小鼠较易引起炎症反应，ICR小鼠的稳定性低于C57BL/6和Balb/c小鼠。

通过对比3个品系乳腺干细胞3D形成率的差异，从而筛选出12孔板形成3D所需细胞的最适浓度。对于基底干细胞来说，C57BL/6小鼠3D种植最适浓度为每孔30 000个细胞，Balb/c小鼠为每孔5 000个细胞，ICR小鼠为每孔20 000个细胞。对于管腔干细胞来说，C57BL/6小鼠3D种植最适浓度为每孔500个细胞，Balb/c小鼠为每孔500个细胞，ICR小鼠为每孔1 000个细胞。Balb/c小鼠不管是基底干细胞还是管腔干细胞都较易形成3D，C57BL/6小鼠管腔干细胞较易形成3D结构，ICR小鼠与C57和Balb/c小鼠相比，乳腺干细胞形成3D能力相对较弱。Wang等[17]发现不同品系小鼠乳腺干细胞克隆形成率不同，即不同品系小鼠乳腺干细胞自我更新和分化能力不同，这与我们的观点不谋而合。

在乳腺干细胞形成的3D结构中，C57BL/6和Balb/c小鼠特别是Balb/c小鼠，管腔干细胞形成的实心结构较多，推测可能是空心的3D结构长实了。Lim等[18-19]的研究证明基底细胞样乳腺癌来源于管腔干细胞，本研究发现，管腔干细胞可以形成基底干细胞形成的实心样3D结构，这就为管腔干细胞形成基底样乳腺癌提供了可能。

ICR小鼠作为一个远交品系，虽然有其优势，但对于乳腺及其相关研究有一定的局限性，选用C57BL/6和Balb/c小鼠较好。不同品系小鼠其形成3D的能力差异较大，应选择最适细胞浓度，但这种差异的产生机制仍需我们进一步探索。