家禽定点屠宰场不同屠宰环节鸡肉表面真菌结构分析

戴宝玲，杨华，王佩佩，戴贤君，夏文锐，肖英平*

(1.中国计量大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

近年来，鸡肉的需求量日益增长，2013年我国鸡肉的产量占中国禽肉产量的70%[1]。是世界消费市场上增长速度最快的优质肉类。鸡肉具有高蛋白质、低脂肪、低热量、低胆固醇等“一高三低”的营养特点[2]，能够提供人体生长发育所需的各种必需氨基酸、脂肪酸、无机盐和维生素等多种营养物质[3]，且肉质细嫩、味道鲜美，价格便宜，已成为最受广大消费者欢迎的肉类食品之一。鸡肉在肉类消费中占据重要位置，人们也逐渐关注其食用的安全性。对禽流感的研究发现，禽类疫病病原的重要集散地是活禽市场[4]。为了防控禽流感的发生与传播，保障鸡肉的质量安全，一些地区开始禁止活禽交易，实行家禽“集中屠杀，定点屠宰，冷链配送，冷鲜上市”管理[5]。一般情况下，细菌被认为是导致肉制品变质的主要原因，有关肉类细菌菌群结构的研究较多，真菌结构的研究鲜有。肉类在保鲜时环境更适合真菌的生长，易于被酵母腐败影响肉质[6]。由于某些屠宰场条件差，加工不规范，区域温度适宜，而鸡肉营养丰富，难免会感染微生物，成为其生长的培养基，导致鸡肉产品存在食用安全隐患。鸡真菌感染主要包括曲霉菌病、冠癣、鹅口疮等, 这些真菌在鸡上营寄生生活, 引起沉重的慢性疾病[7]，给人们的健康带来一定的威胁。本研究对脱毛、净膛、预净、包装和冷藏环节中鸡肉真菌结构进行研究，旨在为保障鸡肉的食用安全及改善屠宰场的卫生水平提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在浙江某家禽定点屠宰场不同的屠宰环节，包括脱毛(D)、净膛(E)、预净(Pr)、包装(Pa)、冷藏(C)，每个环节随机抽取5只鸡，装于无菌袋中，编号分别为D1～D5，E1～E5，Pr1～Pr5，Pa1～Pa5，C1～C5。在无菌室中，每个鸡肉样品加入与1/2只鸡等重的无菌生理盐水，振荡1 min，静置10 min后取20 mL上清液离心。

1.2 仪器

离心机，生工生物工程(上海)股份有限公司；Illumina测序仪，美国Illumina公司；PCR扩增仪，德国Biometra公司。

1.3 真菌DNA提取及扩增

采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM(Zymo Research)试剂盒对鸡肉表面真菌DNA 进行提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测。以DNA 为模板，ITS2引物ITS3-2024-F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4-2409-R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对鸡肉表面真菌DNA进行PCR 扩增，产物进行ITS测序分析。

1.4 高通量测序及生物信息学分析

应用高通量技术对定点家禽屠宰场鸡肉表面真菌ITS的ITS2区域进行扫描测序，QIIME软件(http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)对获得的序列进行过滤筛选，获得高质量的DNA序列[8-9]。通过计算α-多样性指数(ACE指数、Chao1指数、香农指数和辛普森指数)，对真菌群落的组成、多样性和测序深度进行表征，基于OTU聚类分析，绘制稀释性曲线、真菌结构柱状图、丰度热点图及主坐标分析图，评估屠宰场各个环节鸡肉表面真菌污染状况。

1.5 统计

采用SPSS统计软件进行方差分析(ANOVA)，对有显著性差异的处理进行t检验。

2 结果与分析

2.1 鸡肉样品真菌的测序概况

根据聚类分析，共得到4 908个OTU，α-多样性指数统计的结果如表1所示。家禽定点屠宰场5个环节鸡肉表面的真菌群落丰富度均无显著性差异。

表1 样品真菌的测序概况

稀释曲线是用来比较不同样品中测序后菌群的丰度及深度，从而反应测序的结果是否合理[10]。鸡肉样品真菌群落稀释曲线见图1。由图可知，样品曲线趋于平缓，说明测序的数据量能够展现出样品中物种的真实多样性组成。其中，包装环节鸡肉表面真菌群落的平均相对丰度最高。

图1 各样品的稀释曲线

2.2 不同环节鸡肉携带的真菌结构

根据鸡肉基因组DNA提取、高通量测序、生物信息学分析，构建微生物群落组分图(图2)，在微生物分类门的水平上得知，鸡肉表面主要分布的真菌门为担子菌门、子囊菌门、接合菌门和壶菌门。优势类群为比例超过96%的真菌群落，包括担子菌门和子囊菌门，且5个环节鸡肉表面携带的担子菌门较丰富，平均相对丰度范围为69.1%～82.7%。

图2 各样品表面真菌群落组分的丰度(门水平)

热图[11]可将高低丰度的物种分块聚集，通过颜色的深浅及相似程度来反映多个样品在属水平上群落组成的相似性和差异性(图3)。根据计算各类真菌在整体中所占比例，属水平上将真菌群落分为主要类群和优势类群(表2)。优势菌属为毛孢子菌属，5组中平均相对丰度分别为63.6%(D)、64.4%(E)、72.8%(Pr)、65.6%(Pa)和71.5%(C)。另外还检测出有隐球菌属,曲霉属等病原真菌和假丝酵母属(Candida)等腐败酵母。

2.3 样品的聚类与主坐标

根据5组中各个鸡表面样品OTU计算样品间的加权UniFrac距离，对25个样品进行主坐标分析(PCoA)。如图4，PCo1和PCo2分别解释36.03%和22.87%差异性。结果表明，来自同一环节鸡的样品几乎是聚集，脱毛与净膛和冷藏的样品有差异。

图3 各样品表面真菌群落组分属水平的丰度

表2 不同环节鸡肉病原真菌和腐败酵母相对丰度 %

图4 各样品差异的主坐标分析

3 讨论

鸡肉营养丰富，给微生物生长提供了良好的环境，在屠宰的不同环节会受到污染，如果污染致病菌，将会导致食源性疾病[12-13]。通过高通量测序技术对屠宰场各个屠宰环节鸡肉表面病原真菌的检测可以看出，高通量测序技术克服了传统培养方法中的一些不足，快速获取了鸡肉表面大量真菌菌群的信息。基于高通量测序平台有效序列聚类分析可知，包装环节鸡肉表面真菌群落多样性及丰度最高，可能是因为包装间杀菌不彻底，造成真菌大量繁殖，从而污染鸡肉，或包装时工作人员未清洗消毒，通过皮肤、头发、衣服等将真菌带入，进而污染肉品[2]。

基于不同分类地位的分析显示，担子菌门是定点屠宰场不同屠宰区域中鸡肉表面的优势真菌类群，这与前人对土壤真菌群落研究结果相似[14-15]。也有学者研究了人类皮肤真菌发现，担子菌门丰度较高[16]，说明可能是空气中或人员携带的灰尘附着在鸡肉表面引起污染。

鸡肉表面的优势真菌属是毛孢子菌属，常引起毛孢子菌病[17]，目前认为在毛孢子菌属中可以引起人类疾病的菌种有13种[18-19]。蒋玲玉等[20]研究肺真菌病患者致病菌的构成发现，曲霉属和隐球菌属较常见。隐球菌属中的罗伦隐球酵母和假丝酵母属中的诞沫假丝酵母在肉制品保藏时适宜生长，易引起酵母腐败。本实验在鸡肉表面检测出一定量隐球菌属真菌，这些真菌不但在鸡肉冷冻保鲜后改变其感官品质，影响其货架期[21]，而且使鸡肉存在食用安全隐患。

基于高通量测序技术的高效、快速特点，利用高通量测序分析定点屠宰场不同屠宰环节鸡肉表面的真菌结构可知，鸡肉表面优势菌门为担子菌门和子囊菌门，其中担子菌门最丰富，占69%以上。毛孢子菌属为优势菌属，占63.6%～72.8%。此外还有病原真菌隐球菌属和曲霉属及腐败酵母假丝酵母属等的检出。