全波长扫描式多功能读数仪-靛酚蓝比色法测定水样铵态氮含量

郭文淼，辛 宇，，张金尧，汪 洪*

(1.辽宁石油化工大学化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001； 2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081)

铵态氮是评价水质是否受到污染的一个重要指标，铵态氮在水中存在时呈游离氨或铵盐的状态，两者组成主要取决于水的pH值[1]。目前常用水体中铵态氮的测量方法有纳氏试剂比色法、蒸馏-酸滴定法、水杨酸-次氯酸盐分光光度法[1]。纳氏试剂比色法存在试剂毒性大、干扰因素较多、操作繁琐复杂及方法的灵敏度不够高等缺点。蒸馏-酸滴定法适用于氨氮含量较高的测定。而且蒸馏需要一定的时间，测定的时间比较长[1]。水杨酸-次氯酸盐分光光度法灵敏度较好[2]，环保部标准HJ 665-2013和HJ 666-2013分别规范采用连续流动分析仪和流动注射结合水杨酸分光光度法测定水质氨氮[3-4]。靛酚蓝比色法是在高pH值环境下，将水中的铵态氮转化成铵盐的存在形式，测定水中铵态氮，水中铵态氮在强碱性介质中与苯酚和次氯酸钠作用，生成稳定的水溶性染料靛酚蓝，吸光度与铵态氮含量成正比，可在630 nm 处比色测定[5]。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

全波长扫描式多功能读数仪(酶标仪)(型号：Varioskan Flash)、连续流动分析仪(型号：AutoAnalyzer 3)。

1.2 试剂

酚溶液：10.0 g苯酚与0.1 g亚硝基铁氰化钠(硝普钠)溶于1 L水中，放入棕色试剂瓶中于4 ℃储存。

次氯酸钠碱性溶液：5 mL次氯酸钠溶液(10%)和10.0 g柠檬酸三钠，加水约50 mL，再加入55 mL 2 mol/L的氢氧化钠溶液，用水稀释至200 mL，每月更换。

缓冲溶液：将40 g柠檬酸钠溶于约600 mL水中，稀释至1 000 mL，再加入1 mL十二烷基聚乙二醇醚Brij-35，30%溶液，并混合均匀。每周更换。

水杨酸钠溶液：将8 g水杨酸钠溶入约120 mL去离子水中，加入0.2 g硝普钠，稀释至200 mL并混合均匀，每周更换。

二氯异氰尿酸钠溶液：将4 g氢氧化钠和0.6 g二氯异氰尿酸钠溶入约120 mL去离子水中，稀释至200 mL并混合均匀。每周更换。

1 000 mg/L的NH+4-N标准储备液：用硫酸铵配制。

所用试剂为分析纯，用水为三级去离子水。

1.3 实验步骤

选择酶标仪96孔微孔板：每个孔中加入130 μL待测水样，显色剂(酚溶液)与反应试剂(次氯酸钠碱性溶液)各加入65 μL。放入30 ℃恒温箱培养30 min，然后进行比色测定。在200～900 nm波长范围内扫描测定吸光度，最大吸收波长确定在630 nm处。6个水样显色稳定15、30、60、90、120、150、180 min时，在最大吸收波长处测定吸光度，确定显色稳定时间为30 min。

配制0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mg/L浓度NH+4-N标准溶液，按照上述条件测定吸光度，与标准NH+4-N溶液浓度之间进行线性回归，制作标准曲线，直线回归方程Y=0.476 7X+0.039 9，R2为0.999 5。微孔板孔里不加NH+4-N标准溶液，为试剂空白(空白为质量浓度为0 mg/L的标准溶液)实验。

图1 酶标仪-靛酚蓝比色法的工作曲线

1.4 连续流动分析仪-水杨酸比色方法测定步骤

参照环保部标准HJ 665[3]，水样中铵态氮与水杨酸钠和二氯异氰尿酸钠反应生成蓝色化合物，加入的硝普钠是作为催化剂，利用连续流动分析仪在660 nm波长下检测：试样与试剂在蠕动泵的推动下进入化学反应模块，在密闭的管路中连续流动，被气泡按一定间隔规律隔开，并按特定的顺序和比例混合、反应，显色完全后进入流动检测池进行吸光度检测。设置进样速率60个/h，进样与清洗比为3.0∶1，进样时间45 s，清洗时间15 s。仪器默认设置基线和漂移校正，自动基线参比为4%；比色滤光片波长为660 nm，灯强度大于 1 000 mV。

1.5 统计分析

每个水样品重复测定6次，6次测量值Xi的算术平均值为样品铵态氮含量的估计值，即测量结果。标准偏差用贝塞尔公式计算，即：

连续流动分析仪-水杨酸分光光度法和酶标仪-靛酚蓝比色法测定数据间差异显著性采用Excel软件中分析工具库t-检验，进行成对双样本均值分析。测定数据之间进行相关分析，利用直线方程进行回归，并统计分析相关系数的显著性。

2 结果与分析

2.1 酶标仪-靛酚蓝比色法检出限

进行重复测定多个试剂空白实验(不加NH+4-N标准溶液，其他操作程序相同)。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)检出限测定方法[8]，检出限MLD=3×SD，SD为空白测定结果的标准方差(图2)，得到方法检出限为0.046 mg/L。

图2 酶标仪-靛酚蓝比色法测定水中铵态氮的检出限

2.2 酶标仪-靛酚蓝比色法测定精密度

在相同的测量条件下，利用酶标仪-靛酚蓝比色法对每个水样中铵态氮含量进行6次重复测量，测定结果重复性较好，相对标准偏差在1.6%～2.8%范围内，小于3.0%(表1)。

表1 水样铵态氮质量浓度的重复性测定结果

2.3 酶标仪-靛酚蓝比色法测定准确度—加标回收率

选择6个水样，加入浓度分别为0.50、0.60和0.70 mg/L 的NH+4-N标准溶液，按照同样实验步骤操作，进行加标回收实验，测定结果见表2。从表中可见，样品加标回收率在90.7%～101.8%之间。

表2 样品中铵态氮加标回收实验测定结果

2.4 酶标仪-靛酚蓝比色法与连续流动分析仪测定结果比较

图3列出了酶标仪-靛酚蓝比色法和连续流动分析仪-水杨酸分光光度法对水中铵态氮的测定结果，两种方法测定的水中铵态氮含量范围分别为0.172～1.307和0.173～1.296 mg/L，平均值分别为0.740和0.735 mg/L，t检验的双尾P值小于0.01(表3)，32个样品利用两种方法测定，结果彼此间无显著差异。

项目酶标仪-靛酚蓝比色法连续流动分析仪-水杨酸分光光度法平均0.780.81方差0.070.09样品数3232泊松相关系数0.976df31P(T≤t)双尾0.005t双尾临界2.040

对两种方法测定铵态氮含量结果之间进行相关性分析(图4)，得到回归直线方程为Y(连续流动分析仪-NH+4-N)=1.052 4X(酶标仪-NH+4-N)-0.009，R2=0.952 7**(n=32，P<0.01)，线性方程斜率为1.052 4，接近1。

图4 酶标仪与连续流动分析仪测定水样铵态氮质量浓度结果的相关性分析

3 讨论与结论

本文采用全波长扫描式多功能读数仪(酶标仪)结合靛酚蓝比色法测定水中铵态氮，基于的原理是在碱性条件下，以亚硝基铁氰化钠为催化剂，样品中铵离子与次氯酸盐和苯酚反应生成蓝绿色化合物，在波长660 nm处测定，该反应中一个重要的条件是混合液显色适宜pH值维持碱性，约为10.0～13.0左右[5,9]。水体中的金属离子如铁、锰、镁、钙等，在碱性条件下因产生浑浊干扰测定[10]。张卫宏等[11]报道了通过加入掩蔽剂(EDTA 和酒石酸钾钠)来消除干扰，但作者采用流动注射分析方法，进样频率高，管路清洗时间短，可能导致样品之间的交叉污染，该文测定值和加标回收率偏高。黄晓[12]采用适当降低显色pH值，使最终pH值控制在10.51～10.57范围，适用于河口和近海NH+4-N的高精度测定，准确度较高。本研究采用全波长扫描式多功能读数仪(酶标仪)结合靛酚蓝比色法测定水中铵态氮，比色前，显色剂与样品在微孔板里充分混匀，微孔板每孔独立，不存在样品之间交叉污染问题，试剂空白值较稳定，检出限为0.046 mg/L。方法的加标回收率在90.7%～101.8%之间，与连续流动分析仪-水杨酸分光光度法相比，两者测定数据之间呈直线线性关系，回归直线方程为Y(连续流动分析仪-NH+4-N)=1.052 4X(酶标仪-NH+4-N)-0.009，相关系数R=0.976 1**(n=32，P<0.01)。方法精密度较高，重复测定相对标准偏差小于3%。本文结论认为全波长扫描式多功能读数仪(酶标仪)结合靛酚蓝比色法测定重现性好，结果准确，快速方便，可用于水样中铵态氮含量测定。