乳腺癌组织中GSTP1和BRCA1及MGMT基因甲基化状态及其与临床病理特征的关系研究

钱小英，林海锋，周安喜，卓曼云

乳腺癌患者数量在全球范围内呈不断上升趋势，已成为临床重大难题之一［1］，其多发生于乳腺上皮组织，是一类恶性肿瘤。近年来，辅助诊断乳腺癌的启动子甲基化逐渐成为生物化学及医学界的研究重点和热点［2］。研究表明，多个癌基因及CpG位点的联合检测比单个癌基因更有利于诊断乳腺癌和揭示乳腺癌的临床分型和分子病理机制［3］。同时许多维持机体正常活动的DNA可能因乳腺癌启动子区CpG位点的甲基化而丧失其功能［4］。为加深对乳腺癌演变机制的认识，本研究将重点针对乳腺癌组织中胱甘肽S转移酶P1（GSTP1）、乳腺癌易感基因1（BRCA1）/O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）基因甲基化情况及其与临床病理特征的关系进行分析，以期为乳腺癌的发生发展以及临床诊治提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：（1）＞18岁女性；（2）组织标本经过病理学检测后确诊为乳腺癌；（3）行乳腺癌切除术前接受放射治疗、化学药物治疗等；（4）知情同意并自愿参与本研究。排除标准：（1）伴有严重心、肝、肾功能不全或合并有其他高危疾病；（2）有神经系统疾病史、精神疾病史以及近期服用精神疾病药物；（3）有凝血功能障碍或其他手术禁忌证；（4）临床资料不全。

1.2 研究对象 选取2015年1月—2016年6月海南医学院第二附属医院收治的符合纳入标准的乳腺癌患者100例为研究对象，年龄为24～75岁，平均年龄（43.6±9.8）岁。本研究获得本院伦理委员会批准。

1.3 研究方法 乳腺癌切除术中取患者乳腺癌组织及其边缘5 cm处癌旁组织，分析患者乳腺癌组织临床病理特征，并立即放入温度为-196 ℃的液氮速冻箱中保存。

1.3.1 DNA的提取及亚硫酸处理 通过组织DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）对患者乳腺癌组织中GSTP1、BRCA1、MGMT基因DNA进行提取，然后通过EZ DNA甲基化试剂盒-Gold（北京中西远大科技有限公司，型号BTT3-D5024）对200～500 ng DNA进行亚硫酸处理。试验操作均按照试剂盒说明书进行规范操作，操作过程保证无污染。

1.3.2 甲基化特异性聚合酶链式反应（PCR）和电泳分析 加入1.5 μl经亚硫酸盐修饰的DNA模板、1.5 μl 10×缓冲液（含Mg2+）、0.12 μl Hotstar Taq DNA聚合酶、0.15 μl 20 nmol/L的下游引物、0.15 μl 20 nmol/L的上游引物、0.45 μl 20 mmol/L的dNTPs，混合调整后体积为15 μl，进行反应。反应结束后，取PCR产物5 μl进行凝胶电泳。以经过甲基化处理的DNA作为阳性对照，以未经过甲基化处理的外周血淋巴细胞DNA（全基因组扩增）作为阴性对照。GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特异性PCR扩增基因的引物序列见表1。

表1 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特异性PCR所用引物序列及反应条件Table 1 The primer sequence and reaction conditions of methylationspecific PCR analysis of GSTP1，BRCA1 and MGMT genes

1.4 随访 自患者手术日起开始随访，截止时间为2017年11月，每3个月进行电话随访，终点事件为死亡或失访。记录患者的生存情况、疾病进展情况（局部复发、远处转移、阳性淋巴结等）。

1.5 统计学方法 通过SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料比较采用χ2检验；计量资料以（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；采用Cox回归分析分析GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化状态与乳腺癌患者预后的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及其边缘5 cm处癌旁组织中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化情况 乳腺癌组织中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特异性PCR的代表性结果见图1。在100例乳腺癌组织中，GSTP1基因甲基化的发生率为31.0%（31/100），BRCA1基因甲基化的发生率为26.0%（26/100），MGMT基因甲基化的发生率为20.0%（20/100）；在乳腺癌组织边缘5 cm处癌旁组织中，GSTP1基因甲基化的发生率为12.0%（12/100），BRCA1基因甲基化的发生率为8.0%（8/100），MGMT基因甲基化的发生率为4.0%（4/100）。乳腺癌组织边缘5 cm处癌旁组织中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的发生率低于乳腺癌组织，差异均有统计学意义（χ2=11.481、12.121、10.695，P值均＜0.001）。

在100例乳腺癌组织中，GSTP1、BRCA1、MGMT基因中至少1个基因发生甲基化54例（54.0%），其中3个基因均发生甲基化5例（9.3%）、任意2个基因发生甲基化18例（33.3%）、仅有1个基因发生甲基化31例（57.4%）。在100例乳腺癌组织边缘5 cm处癌旁组织中，GSTP1、BRCA1和MGMT基因中至少1个基因发生甲基化21例（21.0%），其中3个基因均发生甲基化0例、任意2个基因发生甲基化5例（23.8%）、仅有1个基因发生甲基化16例（76.2%）。每例患者乳腺癌组织甲基化基因数为（0.74±0.09），低于乳腺癌组织边缘5 cm处癌旁组织甲基化基因数（0.25±0.03），差异有统计学意义（t=51.650，P＜0.001）。

图1 3种基因在乳腺癌组织中甲基化特异性PCR代表性结果Figure 1 Representative results of PCR analysis of the methylation status of 3 genes in breast cancer tissues

2.2 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化与乳腺癌临床病理特征的关系 不同肿瘤分期、淋巴结转移情况乳腺癌组织中甲基化基因数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同病理类型、人表皮生长因子受体2（HER-2）状态、孕激素受体状态乳腺癌组织中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；癌组织直径≥20 mm、有淋巴结转移乳腺癌组织中GSTP1基因甲基化阳性率高于癌组织直径＜20 mm、无淋巴结转移乳腺癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；年龄＜50岁、雌激素受体阴性乳腺癌组织BRCA1基因甲基化阳性率高于年龄≥50岁、雌激素受体阳性乳腺癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；组织学Ⅲ级、乳腺癌Ⅱ～Ⅳ期、淋巴结有转移乳腺癌组织MGMT基因甲基化阳性率高于组织学Ⅰ～Ⅱ级、乳腺癌Ⅰ期、无淋巴结转移乳腺癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.3 预后情况 100例患者中，治愈73例，疾病进展27例，无死亡病例发生。

2.4 乳腺癌患者预后影响因素的Cox回归分析 以预后为因变量（赋值：治愈=0，疾病进展=1），以GSTP1基因甲基化阳性（赋值：是=0，否=1）、BRCA1基因甲基化阳性（赋值：是=0，否=1）、MGMT基因甲基化阳性（赋值：是=0，否=1）为自变量，进行Cox回归分析，结果显示，GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化阳性是乳腺癌患者预后的影响因素（P＜0.05，见表3）。

表3 乳腺癌患者预后影响因素的Cox回归分析Table 3 Cox regression analysis of the prognostic factors in patients with breast cancer

3 讨论

乳腺癌发生进展的整个过程中，抑癌基因的失活和原癌基因的激活起着关键作用，同时也有其他多个基因表达参与［5-7］。目前认为，基因启动子区的CpG位点的异常甲基化是乳腺癌发展过程中抑癌基因失活的主要原因［8］。因此CpG位点的异常甲基化逐渐成为乳腺癌临床研究的热点。但既往研究主要为单基因分析，故而研究结果不一致。目前已知一些重要基因会因启动子区的CpG位点的异常甲基化而失去其原有功能从而导致细胞癌变，如介导激素和受体、转导细胞信号、调控细胞周期、执行DNA修复和细胞黏附等功能基因［9］。既往报道指出，基因异常甲基化的研究有利于诊断、治疗乳腺癌及其病因探讨［10］。因此进一步探讨乳腺癌相关基因与其演变过程及恶性特征的关系，可以帮助临床及早诊断、治疗乳腺癌。本研究结果显示，乳腺癌组织中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的发生率分别为31.0%、26.0%、20.0%。乳腺癌组织中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的发生率高于乳腺癌组织边缘5 cm处癌旁组织。有54.0%乳腺癌组织至少有1个基因发生甲基化。每例患者乳腺癌组织甲基化基因数高于乳腺癌组织边缘5 cm处癌旁组织。

表2 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化与乳腺癌临床病理特征的关系〔n（%）〕Table 2 Relationship of the methylation status in the promoter regions of GSTP1，BRCA1 and MGMT genes with the pathological features of breast cancer

研究显示，GSTP1、BRCA1、MGMT基因的功能均是执行DNA修复［11］。本研究通过联合分析GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化发现，不同肿瘤分期、淋巴结转移情况乳腺癌组织中甲基化基因数比较有差异。吴亮等［12］的研究亦指出，94.3%的乳腺癌患者至少有1个基因发生甲基化，有淋巴结转移的患者BRCA1基因甲基化阳性率高于无淋巴结转移者，本研究结果与其相似。年龄＜50岁、雌激素受体阴性乳腺癌组织BRCA1基因甲基化阳性率高于年龄≥50岁、雌激素受体阳性乳腺癌组织，提示BRCA1基因甲基化与雌激素通路可能存在一定的相互作用关系。

本研究结果显示不同病理类型、HER-2状态、孕激素受体状态乳腺癌组织的GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化阳性率比较有差异。GSTP1通过参与机体代谢消除人体内的有毒物质从而发挥解毒、抗DNA损伤和抑制细胞癌变的作用［13］。而GSTP1基因启动子区异常甲基化会使其无法表达，因此当该基因发生甲基化时提示该乳腺癌患者预后不良［14］。现代分子生物学研究表明，MGMT基因的正常表达能够修复细胞的烷化损害，维持DNA的稳定［15］。当该基因表达沉默时，机体DNA的转录、翻译过程中会发生各种错误并不断积累直至基因紊乱、崩溃，使得原癌基因及其相关基因活化，产生癌细胞并迅速增殖［16-17］。因此当MGMT基因发生甲基化而无法表达时，乳腺癌患者的疾病会迅速恶化，在乳腺癌分期上表现为较晚分期，提示其能够影响乳腺癌的进展与演变［18］。本研究结果也表明组织学Ⅲ级、乳腺癌Ⅱ～Ⅳ期、有淋巴结转移乳腺癌组织MGMT基因甲基化阳性率高于组织学Ⅰ～Ⅱ级、乳腺癌Ⅰ期、无淋巴结转移乳腺癌组织。进一步分析发现，GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化阳性是乳腺癌患者预后的影响因素。因此，GSTP1、BRCA1、MGMT基因发生异常甲基化时对评估乳腺癌患者预后有一定临床价值。但本研究随访时间较短，未观察到患者总生存期和无病生存期。在以后的研究中，可扩大样本量并延长随访时间以进一步验证。

综上所述，GSTP1、BRCA1、MGMT基因能帮助修复DNA，发生甲基化基因数高于癌旁组织，且其发生异常甲基化时影响乳腺癌病情进展。因此对其进行联合检测甲基化有利于临床诊断、治疗乳腺癌并预测其预后。

作者贡献：钱小英进行试验设计与实施、资料收集与整理，撰写论文并对文章负责；周安喜、卓曼云进行试验实施、评估、资料收集；林海锋进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。