E-钙黏蛋白基因启动子区甲基化在卵巢子宫内膜异位症中作用的研究

樊霞，安冬，李琰，康山*

子宫内膜异位症是一种妇科常见疾病，5%～10%的育龄期妇女患有此病，且30%～50%伴有不孕［1］。目前该病的病因尚不十分清楚。子宫内膜异位症虽然为良性病变，但具有类似恶性肿瘤的生物学行为，有活性的子宫内膜细胞远端转移、侵袭、黏附、生长，形成异位病灶。积累的证据显示与肿瘤转移、侵袭相关的基因在子宫内膜异位症的形成中也起着重要作用［2-4］。

肿瘤抑制基因——E-钙黏蛋白（E-cadherin）的异常表达与肿瘤细胞的增殖、去分化、侵袭和转移均有密切关系。关于子宫内膜异位症的研究也证明E-cadherin缺失的子宫内膜细胞具有转移和侵袭能力［5］，且患者的在位、异位内膜可能存在着E-cadherin的异常表达［6］。

基因启动子区的甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，参与基因的表达调控。前期有研究证实在多种肿瘤细胞中E-钙黏蛋白基因（CDH1）启动子区的高甲基化是导致E-cadherin表达水平下调的重要原因［7-8］。本研究拟探讨卵巢子宫内膜异位症患者在位、异位内膜细胞CDH1启动子区甲基化状态，目的在于探讨CDH1表观遗传学改变与卵巢子宫内膜异位症发生的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究纳入50例卵巢子宫内膜异位症患者和50例由于宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅲ级行子宫切除或子宫探查的患者（对照妇女）。均来自河北医科大学第四医院，纳入时间为2011年10月—2013年8月。卵巢子宫内膜异位症患者经腹腔镜手术确诊，均为Ⅲ～Ⅳ期［9］，年龄22～51岁，平均年龄（36.7±6.8）岁。对照妇女年龄26～55岁，平均年龄（38.5±3.8）岁。本研究经河北医科大学第四医院伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 排除标准 排除合并子宫内膜病变、子宫肌瘤、内分泌疾病及术后病理证实合并其他卵巢良恶性肿瘤的患者。

1.3 标本采集 术中无菌采集卵巢子宫内膜异位症患者的在位内膜（在位内膜组）、异位内膜（异位内膜组）及对照妇女子宫内膜组织（对照子宫内膜组），放入RNAlater溶液（Carlsbad，美国）中，-20 ℃保存。

1.4 DNA提取与甲基化特异性聚合酶链式反应（MSP）

在位内膜组、异位内膜组和对照子宫内膜组DNA采用Wizard®基因组DNA提取试剂盒（Promega，美国）提取。采用NanoDrop 1000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）检测所提取DNA的浓度。1 μg DNA采用BisulFlashTM DNA修饰试剂盒（Epigentek，美国）进行亚硫酸氢盐修饰。修饰后的DNA使用MSP方法检测CDH1启动子区甲基化状态。甲基化引物（M）：5'-GGTGTTTTAGTTAATTAGCCGGTAC-3'（上游）和5'-CATAACTAACCGA AAACGCCG-3'（下游）；非甲基化引物（U）：5'-GGTAGGTGAATTTTTA GTTAATTAGTGGTA-3'（ 上 游） 和5'-CCCATAACTAACCAAAAACACCA-3'（下游）（北京赛百盛生物工程有限责任公司，中国）。PCR扩增产物：甲基化为204 bp，非甲基化为211 bp。以甲基转移酶处理的正常人外周血DNA为模板扩增的PCR产物为甲基化阳性对照标本（甲基化阳性组），正常人外周血DNA为模板扩增的PCR产物为甲基化阴性对照标本（甲基化阴性组），PCR时用水代替模板DNA所得的PCR产物为空白对照（见图1）。

本文创新点：

本研究首次在人体组织中探讨了E-钙黏蛋白基因（CDH1）启动子区甲基化与卵巢子宫内膜异位症的关系。结果提示子宫内膜组织CDH1基因启动子区异常甲基化所致的E-钙黏蛋白异常表达可能在子宫内膜异位症的发生中起重要作用。

图1 CDH1启动子区的甲基化状态Figure 1 Methylation status of the CDH1 promoter

1.5 RNA提取和反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）在位内膜组、异位内膜组和对照子宫内膜组CDH1 RNA采用Trizol试剂盒（Invitrogen，美国）提取。cDNA合成采用Promega反转录试剂盒。RT-PCR引物：（1）E-cadherin（314 bp）：5'-AGTGCCAACTGGACCATTCA-3'（上游）和5'-TCTTTGACCACCGCTCTCCT-3'（下游）；（2）GAPDH（452 bp）：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'（上游）和5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（下游）。PCR产物采用4%琼脂糖胶检测（见图2）。

图2 RT-PCR检测内膜组织CDH1 mRNA表达Figure 2 Expression of CDH1 mRNA detected by PT-PCR

1.6 流式细胞术分析E-cadherin表达水平 将甲基化阳性组和甲基化阴性组子宫内膜组织制备成单细胞悬液，冷PBS冲洗2次后，将细胞悬浮在1 ml含有E-cadherin-FITC或isotype-FITC 抗体的PBS中，室温避光30 min，PBS冲洗后重新悬浮在1 ml PBS中。采用FC500（Beckman Coulter，美国）流式细胞仪检测E-cadherin表达水平（见图3）。

图3 流式细胞术检测内膜组织E-cadherin表达水平Figure 3 Expression of E-cadherin protein detected by flow cytometry

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件对所有资料进行统计分析。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料的比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDH1启动子区甲基化状态 在位内膜组CDH1启动子区甲基化阳性率为26.0%（13/50），异位内膜组为32.0%（16/50），对照子宫内膜组为8.0%（4/50）。3组CDH1启动子区甲基化阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=9.09，P=0.011）；其中在位内膜组和异位内膜组CDH1启动子区甲基化阳性率高于对照子宫内膜组，差异有统计学意义（χ2=5.74，P=0.017；χ2=9.00，P=0.003）；在位内膜组和异位内膜组CDH1启动子区甲基化阳性率比较，差异无统计学意义（χ2=0.44，P=0.509）。

2.2 CDH1 mRNA表达水平比较 甲基化阳性组CDH1 mRNA的表达水平低于甲基化阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.3 E-cadherin表达水平比较 甲基化阳性组E-cadherin的表达水平低于甲基化阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 甲基化阳性、阴性组CDH1 mRNA、E-cadherin表达水平Table 1 Expression of CDH1 mRNA and E-cadherin in methylationpositive and methylation-negative groups

2.4 CDH1 mRNA表达水平和E-cadherin表达水平的相关性 CDH1 mRNA表达水平和E-cadherin表达水平呈正相关（r=0.43，P=0.017）。

3 讨论

3.1 CDH1异常甲基化与卵巢子宫内膜异位症E-cadherin是一种钙依赖性黏附分子，分布于各类上皮细胞，主要介导同种细胞间的黏附反应，维持细胞极性和参与分化调节，对维持组织结构形态和完整性起重要作用。其编码基因CDH1被公认是肿瘤浸润、转移的抑制基因。上皮细胞中E-cadherin表达水平降低可能导致上皮细胞-间充质转化（EMT）。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性、与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。因此，E-cadherin表达丢失在肿瘤的转移、侵袭中起重要作用。子宫内膜异位症患者的内膜细胞也存在着E-cadherin的异常表达。一些研究显示子宫内膜异位症患者子宫内膜腺上皮的E-cadherin表达水平明显降低［10］，相反地，有研究发现患者的E-cadherin表达水平明显高于对照妇女［11］。但体外研究显示E-cadherin表达阴性的子宫内膜细胞具有转移侵袭能力，E-cadherin表达阳性的子宫内膜细胞则不具有转移侵袭能力［5］。因此E-cadherin表达丢失与子宫内膜细胞的转移侵袭密切相关。

E-cadherin表达丢失的机制尚不明确，启动子区的甲基化是基因失活的主要机制之一。前期的研究发现多种上皮性肿瘤组织中存在CDH1启动子区的高甲基化，且异常甲基化所导致E-cadherin表达失活与肿瘤的转移侵袭密切相关［12-14］。然而，有关子宫内膜异位症中CDH1启动子区甲基化的状态及与E-cadherin表达关系的研究还十分有限。WU等［15］证实在2个永生化的子宫内膜异位症的细胞系中，CDH1启动子区为高甲基化状态，细胞具有明显的转移侵袭能力；采用组蛋白脱乙酰酶抑制剂A处理细胞重新活化E-cadherin表达，细胞的侵袭转移能力明显降低。提示至少在子宫内膜异位症细胞系中，CDH1启动子区甲基化导致的E-cadherin表达阴性可能与子宫内膜细胞的转移侵袭相关。本研究结果发现在位、异位内膜组CDH1启动子区的甲基化阳性率明显高于对照子宫内膜组，表明卵巢子宫内膜异位症患者中存在着CDH1的异常甲基化。

3.2 CDH1启动子区甲基化状态与其在子宫内膜组织表达的关系 DNA甲基化是真核生物基因表达调控的重要方式之一，DNA甲基化可以在转录水平抑制基因的表达，且甲基化水平与基因的表达呈负相关。本研究采用RT-PCR和流式细胞术检测了CDH1启动子区内膜组织CDH1 mRNA、E-cadherin的表达水平，发现甲基化阳性组的CDH1 mRNA、E-cadherin的表达水平明显低于甲基化阴性组。基于E-cadherin在卵巢子宫内膜异位症中的作用，推测子宫内膜组织CDH1启动子区的异常甲基化所导致的E-cadherin表达异常可能是卵巢子宫内膜异位症发生的重要原因。

本研究结果可能为探讨卵巢子宫内膜异位症的发生机制提供重要的理论依据，也可能为卵巢子宫内膜异位症的临床治疗提供新的思路。

作者贡献：樊霞、安冬、李琰、康山进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析、数据收集与整理、统计学处理、结果的分析与解释、论文的撰写、中/英文修订；康山负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。