桂花OfCCD1基因启动子克隆与表达特性

刘玉成，王艺光，张 超，董 彬，付建新，胡绍庆，赵宏波

（1.浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300；2.浙江理工大学 建筑工程学院，浙江 杭州310018）

类胡萝卜素是广泛分布于自然界的一类色素，迄今已发现了近800种［1］，主要存在于植物的叶、花、果实和根等器官中，在吸引昆虫、鸟类传播花粉和种子中发挥作用［2］。类胡萝卜素可作为多种生物活性物质的前体，经过氧合酶或非酶裂解作用可以形成阿朴类胡萝卜素［3］，后者及其衍生物可生成β-紫罗兰酮（β-ionone）等香气物质及脱落酸（abscisic acid，ABA）等植物生长调节剂［4］。作为类胡萝卜素裂解氧合酶（carotenoid cleavage oxygenases，CCO）中的重要成员，类胡萝卜素裂解双加氧酶1（carotenoid cleavage dixoygenase 1，CCD1）在不同的植物中所裂解的底物、作用位点不尽相同。研究发现［5］，CCD1在C9～C10（C9′～C10′）位时剪切番茄红素、胡萝卜素、玉米黄质或脱辅基类胡萝卜素等，形成β-紫罗兰酮， β-环柠檬醛（β-cyclocitral）， 香叶基丙酮（geranylacetone）和假紫罗兰酮（pseudoionone）等芳香类物质；在番茄红素 C5～C6（C5′～C6′）位裂解时则形成 6-甲基-5-庚烯-2-酮［6］， 认为 CCD1 对基于类胡萝卜素代谢途径的香气物质合成发挥着重要作用。桂花Osmanthus fragrans在中国栽培历史悠久，集绿化、美化和香化为一体，花香和花色是其重要观赏性状。类胡萝卜素裂解双加氧酶1（OfCCD1）［7］降解桂花中的着色物质——α-胡萝卜素和β-胡萝卜素［8］，合成主要香气物质α-紫罗酮和β-紫罗酮［9］。基因启动子控制着基因在特定的组织［10］、特定的发育阶段［11］以及一定的环境条件下表达［12］；分离相关基因启动子，分析其序列及其作用元件，并研究其功能，可明确该基因的调控因子及其作用机制。本研究利用染色体步移技术克隆了OfCCD1启动子，通过启动子序列分析、载体构建和瞬时表达分析，初步明确了其功能，为揭示OfCCD1基因调控花色花香代谢机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为6～8年生地栽丹桂品种 ‘堰虹桂’ ‘Yanhong Gui’，栽植于浙江农林大学桂花资源圃。

1.2 主要试剂

Taq聚合酶、限制酶（DraⅠ，EcoRⅤ，PvuⅡ，StuⅠ），质粒载体PMD18-T，大肠埃希菌Escherichia coliDH5α，胶回收试剂盒，DNA片段纯化试剂盒和无缝连接试剂盒均购自Takara公司（大连）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 参照十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取 ‘堰虹桂’基因组DNA［13］。

1.3.2 引物设计与合成 根据 ‘堰虹桂’转录组数据库中的CCD1序列（GenBank登录号MG138152）［14］和 BALDERMANN 等发表的OfCCD1（GenBank登录号 AB526197.1）序列［9］， 用 Primer Primer 5.0设计下游特异性引物1（GSP1），特异性引物2（GSP2）和特异性引物4（GSP4）；利用上述2段序列的重复序列设计特异性引物3（GSP3）；利用接头引物1（AP1）与GSP1，接头引物2（AP2）与GSP2经2轮聚合酶链式反应（PCR）获得的启动子片段设计特异性引物5（GSP5）。利用pBI121质粒上的β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucosidase，GUS）基因序列设计上游引物GUS-F和下游引物GUS-R。引物及接头均由上海生工合成（表1）。

1.3.3 DNA文库的构建、扩增 ①DNA文库的构建。分别用DraⅠ，EcoRV，PvuⅡ，StuI 4种限制性内切酶对提取到的DNA进行酶切。酶切体系为基因组DNA 25.0 μL（100 mg·L-1），限制内切酶8.0 μL， 10×限制酶 buffer 10.0 μL， 灭菌水 57.0 μL， 总体积 100.0 μL，37 ℃过夜。 取 5.0 μl酶切产物用质量分数0.6%琼脂糖进行检测。按照DNA纯化试剂盒的说明书对酶切产物进行纯化后加接头。分别取4组酶切纯化的DNA各4.8 μL，染色体步移接头GWA 1.9 μL，10×连接缓冲液0.8 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，16.0℃过夜；70.0℃水浴5 min，加入32.0 μL去离子水。② 聚合酶链式反应（PCR）扩增。取AP1， 引物 GSP1/GSP3， 模板各 1.0 μL， 预混合Taq酶 10.0 μL， 去离子水补至 20.0 μL进行第 1轮PCR。扩增程序为94.0℃ 5 min；94.0℃ 25 s，72.0℃ 3 min，7循环；94.0℃ 25 s，65.0℃ 3 min，32循环；67.0℃ 7 min。取第1轮产物1.0 μL并稀释50倍作为第2轮PCR的模板。第2轮PCR体系为：AP2，GSP2/GSP4/GSP5，模板各1.0 μL，预混合Taq酶10.0 μL，去离子水补至20.0 μL。扩增程序为94.0℃ 5 min；94.0℃ 25 s，72.0℃ 3 min，5循环；94.0℃ 25 s，65.0℃ 3 min，20循环；67.0℃ 7 min。取GUS-F，GUS-R和pBI121质粒各1.0 μL，预混合Taq酶10.0 μL，去离子水补至20.0 μL进行GUS序列扩增。扩增程序为95.0℃5 min；95.0℃30 s，69.8℃30 s，72.0℃1 min，35循环；72.0℃10 min；4.0℃10 min。质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 OfCCD1启动子克隆所用引物Table 1 Primer sequences used in the cloning of OfCCD1 promoters

1.3.4 PCR产物回收、连接、转化鉴定及序列测定与分析 切胶回收按照MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa，大连）的说明书进行。载体连接按照PMD18-T载体说明书（Takara，大连）进行，连接后的重组质粒导人大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，在50 mg·L-1氨苄青霉素的固体LB培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落菌液PCR检测后将阳性克隆送公司测序。序列初步分析采用DNAMAN软件进行。启动子序列作用元件分析采用在线网站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行。

1.3.5 表达载体的构建及瞬时表达分析 根据获得的OfCCD1的启动子序列，利用Takara（http：//www.clontech.com）无缝连接引物设计软件设计3对无缝连接引物CCD1P-S-F和CCD1P-S-R，CCD1P-L-F和CCD1P-L-R，GUS-F和GUS-R。具体操作步骤按照Takara无缝连接试剂盒的说明书进行。将重组好的表达载体利用冻融法转入农杆菌Agrobacterium tumefaciensGV3101感受态。随后将烟草Nicotiana tabacum叶片剪切成0.5 cm×0.5 cm的叶块，在农杆菌菌液吸光度D（600）为0.6的侵染液中浸染10 min；无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将侵染的外植体移至于无菌水浸润的滤纸上培养24 h并进行GUS染色，37℃下保温16～24 h。V（乙酸）∶V（乙醇）=3∶1的混合液脱色后取出，对染色结果进行拍照。

2 结果与分析

2.1 启动子克隆

以 ‘堰虹桂’DNA为模板，分别利用引物GSP1和GSP2，接头引物AP1和AP2进行2轮PCR，在EcoR文库扩增得到条带；经比对和拼接得到长度为511 bp的序列（图1A）。利用引物GSP3和GSP4，接头引物AP1和AP2经过2轮PCR，在DraI文库中得到约2 000 bp的条带（图1B）。测序后，经比对和拼接得到长度为2 747 bp的条带，命名为OfCCD1P-L（图2）。利用GSP3和GSP5经过2轮PCR后在PvuⅡ文库中得到750 bp左右的条带（图1B），经过拼接比对得到OfCCD1上游981 bp的启动子序列，命名为OfCCD1P-S（图 3）。

2.2 启动子序列分析

利用PlantCARE网站对启动子序列进行序列分析发现，OfCCD1P-L有TATA-box和CAAT-box等基本作用元件，同时有7个响应元件，响应茉莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸、乙烯的元件，以及热激元件，鸟类成髓细胞性白血病病毒癌基因同源物（MYB）结合位点，并有4个响应脱落酸（ABA）的核心序列ACGT（表2）。OfCCD1P-S中含有TATA-box和CAAT-box等基本作用元件，同时有3个光响应元件，1个热激响应元件以及1个ABA响应元件（表3），并有4个ABA响应元件（ABRE）核心序列ACGT。

图1 OfCCD1启动子克隆电泳图Figure 1 PCR products of OfCCD1 promoters

表2 OfCCD1P-L中顺式作用元件Table 2 Cis-acting elements in OfCCD1P-L

2.3 植物表达载体构建与瞬时表达分析

将克隆得到的启动子和GUS片段分别与pBI121质粒进行重组（图4），以含GUS∶∶GUS表达载体的菌株为阴性对照（ck1），以含pBI 121载体菌株为阳性对照（ck2），对构建的OfCCD1P-L∶∶GUS和OfCCD1P-S∶∶GUS表达载体进行瞬时表达分析（图5）。从图5可以看出，阴性对照没有着色，阳性对照着色范围和程度最好，OfCCD1P-L∶∶GUS表达载体和OfCCD1P-S∶∶GUS表达载体均有着色，但着色都比阳性对照要弱。

3 讨论

图2 OfCCD1P-L序列Figure 2 Sequence of OfCCD1P-L

图3 OfCCD1P-S序列Figure 3 Sequence of OfCCD1P-S

表3 OfCCD1P-S中顺式作用元件Table 3 Cis-acting elements in OfCCD1P-S

桂花OfCCD1基因有2个拷贝［14］。在启动子克隆过程中，第1次步移并未得到足够长的序列。目前，已报道的OfCCD1序列有2个：ZHANG等［14］发现的CCD1序列（GenBank登录号MG138152）和 BALDERMANN发表的OfCCD1序列（GenBank登录号AB526197.1）［9］。 本研究利用上述2个序列的重复序列设计了引物GSP3，并在GSP3 5′上游设计了GSP4，利用已获得的部分OfCCD1启动子序列设计了引物GSP5，分别步移从而获得了OfCCD1P-S和OfCCD1P-L的启动子序列。其中OfCCD1P-L长度为2 747 bp，OfCCD1P-S长度为981 bp。原因是OfCCD1启动子区域的2个拷贝所含酶切位点不同，构建文库时OfCCD1P-L启动子区域被内切酶截断的区域短，步移得到的启动子就较长；而OfCCD1P-S启动子区域大部分被截断，所得的启动子序列就较短。类似地，已报道的CCD家族其他成员的启动子长度也有差异，如拟南芥Arabidopsis thaliana的AtCCD7［10］和AtNCED2［15］，花生Arachis hypogaea的AhNCED1［16］启动子都有 2 000 bp 左右， 而菊花Chrysanthemum morifolium的CmCCD4a-5［17］和桂花的OfCCD4［18］启动子则分别为 1 094 bp和 1 337 bp。 上述文献中进行启动子克隆所用方法不尽相同，这也是造成获得启动子长度不一的因素。

图4 OfCCD1的2个启动子重组质粒图Figure 4 Recombinant vectors of two OfCCD1

图5 瞬时表达检测Figure 5 Detection of transient expression

本研究所获得的2个OfCCD1启动子所含元件种类是具有一致性的，都含有光响应元件、热激响应元件和ABA响应元件，其中较多的是光响应元件。在桂花中，OfCCD1的表达受光照影响［9］，证实了OfCCD1启动子中的光响应元件的存在。同一个亚家族的其他成员，如CCD4［19］和CCD2［20］的启动子中也发现了光响应元件。这表明光响应元件在CCD家族的启动子中可能是普遍存在的。不过功能上可能有差异，因为在藏红花Crocus sativus中，CsCCD2的表达是受光抑制的［20］。

此外，克隆得到的2个启动子中含有4个ACGT序列［21］。ACGT是启动子中一个重要的顺式作用元件，该序列可以响应水杨酸（salicylic acid，SA），紫外线，ABA和茉莉酸（jasmonic acid，JA）［22］的处理。有研究表明：响应ABA至少需要2个ACGT序列，且2个ACGT之间的碱基数不同，响应的激素种类也不同。MEHROTRA等［23］的研究发现：当2个ACGT序列之间的距离是5 bp时，这段序列响应SA的处理；当距离是25 bp时，该序列响应ABA处理。在碱蓬Suaeda salsa［24］和大豆Glycine max［25］中ABA处理会使CCD1的表达量升高，因此，桂花中OfCCD1的表达极有可能响应ABA的诱导，具体的响应机制还需要进一步研究。

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