乳铁蛋白促进骨健康作用的研究进展

张基亮，张兰威,2，马莺，韩雪

(1.哈尔滨工业大学化学与化工学院，哈尔滨150090;2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003)

0 引言

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是1939年由Sorensen等人分离得到的“红色蛋白”。该蛋白是一种非血红素转铁蛋白，由人、牛、羊和马等的上皮细胞合成多存在于乳、泪等分泌物中，与血清转铁蛋白、卵转铁蛋白和黑素转铁蛋白共同组成了转铁蛋白家族[1]。LF是一种多功能性的糖蛋白，分子量大约为80 ku，具有促进骨生长、抗微生物、抗炎、抗癌、免疫调节和酶活性等功能[2]。为了确定LF是否能被完整的吸收利用，Hutchens等用[13C]标记富含亮氨酸、[15N2]或[2H4]标记富含赖氨酸的人源LF（human lactoferrin，hLF），以48 h为周期喂养早产儿，收集每个早产儿96 h的尿液，通过亲和色谱、高效反向色谱和质谱检测的方法对尿液中的LF及其片段进行分析。结果表明，完整的LF是通过肠道吸收并且排泄到尿液中，并且几乎所有尿液中LF都来源于母乳，证明了食源性LF可通过婴儿肠细胞转运并进入系统循环加以利用的[3]。近年来，食源性乳铁蛋白促进骨健康作用得到了研究者的广泛关注[4-5]。针对于此本文阐述了LF促进成骨细胞增殖、分化和生存，以其机制的研究进展。

骨质疏松被定义为骨密度的降低和骨微观结构的改变，骨微观结构的改变增加了骨折敏感性。骨流失是由成骨细胞和破骨细胞活性失衡的结果，成骨细胞的生存有助于保证成骨细胞和破骨细胞的比例，维持成骨细胞发挥较高的活性，从而对骨健康起到有益的作用。LF在体内有效地促进骨区域性增加的机制可能是LF促进成骨细胞有丝分裂作用和抑制破骨细胞形成作用结合所致的，LF对于骨的作用实际上是使骨的总体积增加，表明LF是成骨细胞的生存因子，同时也是骨调节的效应物[6]。

1 乳铁蛋白抑制成骨细胞凋亡机制

Andrew Grey等研究发现，但用LF的生理浓度（1～10 ug/mL）作用细胞时，可以在血清用尽时有效地抑制鼠前体成骨细胞和骨肉瘤细胞的凋亡，并且认为LF抑制成骨细胞的凋亡是促使成骨细胞增多的一个有效途径[7]；Jillian Cornish通过转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（TUNEL）试验中阳性细胞数量来确定细胞的凋亡情况，发现当LF的浓度为10μg/mL时，其抑制成骨细胞的凋亡率高达50%

～70%[4]

。

LF进入细胞是通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）的内吞作用实现的，LRP1具有调节细胞内信号的能力，可以使酪氨酸和丝氨酸磷酸化。普遍认为，磷脂酰激醇3-激酶（PI3K）依赖性蛋白激酶（Akt）磷酸化的激活是使生长因子促进细胞生存的机制。研究表明，在鼠初级成骨细胞培养时添加LF导致Akt的快速磷酸化，且Akt磷酸化程度与LF呈剂量关系，Akt可以被特殊的PI3K抑制剂LY294002所抑制[8]。成纤维细胞中表达的天然LRP1与非成纤维细胞的LRP1相比中，LF不能选择性地阻止细胞凋亡，但在成骨细胞中LF激活PI3激酶依赖激酶的信号，使成骨细胞增殖。用LRP1的抑制剂受体相关蛋白（RAP）共同处理不能抑制LF诱导的Akt磷酸化，没有影响LF促进细胞生存的能力，表明LF的作用独立于LRP1的作用之外[9]。Andrew Grey等将LRP1/2抑制剂以等量或高于其抑制LF诱导成骨细胞或成纤维细胞增殖的量添加到细胞培养基中，结果没有影响LF诱导细胞生存，后又通过凋亡细胞标记的方法以光谱分析从细胞培养中释放的染料，证明LF抗凋亡活性不需要LRP1[7]。即LF提高细胞生存的分子机制有别于基本的有丝分裂作用，通过不依赖于细胞膜的受体来调节的[10]。

蛋白酶3（caspase 3）活性，是细胞凋亡的标志。Ashley A.Amini等用重组人乳铁蛋白（rhLF）处理成骨细胞系MC3T 3-E1时，以抗凋亡因子作为阳性对照用于caspase3实验，rhLF处理组的caspase3活性要明显低于溶媒组的caspase3活性，表明rhLF可以通过调节caspase 3的活性来发挥其抑制细胞凋亡的能力。另外，LF还有提高一些具有阻止由血清缺少引起的细胞凋亡的细胞外因子（Wnt）的表达，如Wnt3和Wnt5。调节Wnt5的抗凋亡作用信号途径是蛋白激酶A（PKA）/cAMP相应结合蛋白（CREB）。实验表明当用rhLF处理细胞24 h后，在细胞外因子家族中的Wnt5上升了3.8倍[11]。

2 乳铁蛋白促进成骨细胞增殖和分化

有丝分裂是维持个体正常生长和发育所必须的，对于骨细胞来说适当地促进成骨细胞的有丝分裂可以促进骨的健康。体外研究发现，LF可以刺激成骨细胞的增殖和分化，Jillian Cornish等用浓度为1-100 μg/mL的LF培养小鼠成骨样细胞，以胸苷插入的增加量来衡量细胞的增殖，结果发现成骨细胞的增殖和分化都与LF成剂量关系，当LF的浓度达到10μg/mL时，胸苷插入数量是对照组的两倍。成骨细胞分化的作用包括骨基质沉淀和矿化两方面，当培养鼠成骨细胞3周时，骨结节形成数量的增多和矿化骨形成区域增加也同样是与LF剂量相关的。只有当LF的浓度达到100μg/mL或者更高时，其促进成骨细胞分化作用才有显著的效果，表明刺激成骨细胞分化所需LF的浓度是刺激成骨细胞增殖所需的10倍。体内实验中，分别将LF、白蛋白和溶媒在成年雄性鼠头骨连续注射5天，结果发现只有LF可以使鼠头骨矿化率和骨形成呈区域性增加，且形成的新骨与LF剂量相关[4]。Takayama等研究表明，LF可以提高人类成骨细胞系MG63碱性磷酸酶活性以及骨钙素的量[12]。当将LF注射在鼠颅骨时，发现在未注射LF的颅内侧和对侧都有骨增加，LF这种促进骨生长的作用是其他一些具有促进骨生长如降钙素、甲状旁腺素和肾上腺髓质素所没有的，LF能在其注射位置很远的地方促进新骨的形成，进一步证实LF有效地增加骨生长。

基因表达差异研究表明，LF在调节成骨细胞有丝分裂活性方面可能的作用是激活一些因子，其可能的生理学功能是在骨生长和康复方面是一个正调节因子[4]。LF具有诱导成骨细胞合成生长因子、细胞因子和趋化因子的能力。其中包括血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF），成纤维细胞生长因子（FGF）和白细胞介素-6（IL-6）等[13]。牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin，bLF）增加小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠初级成骨细胞VEGF和FGF-2的mRNA表达以及这两种蛋白在细胞内的水平；体内外试验证明，IGF-1作为内分泌和旁分泌调节骨代谢，尤其是在富含IGF-1的头骨组织中[14]。在体外，IGF作为合成代谢物刺激细胞增殖，加强成骨细胞分化作用，提高骨基质合成并且阻止细胞凋亡。在IGF-1缺失的细胞中，细胞增殖和碱性磷酸酶活性都急剧下降，在敲除IGF-1或者其受体的鼠模型中骨形成的下降是非常明显，表明IGF-1表达的减少强烈地降低成骨细胞的增殖和分化[15]。另外，缺失IGF-1表达的细胞几乎停止了有丝分裂，使得LF促进成骨细胞分化作用消失。在正常细胞培养时，bLF的添加使得IGF-1mRNA表达水平升高，10μg/mL的bLF显著的提高其mRNA的表达，当LF浓度达到100μg/mL时，mRNA的表达量为最高，并且bLF的添加还可以使IGF-1R的mRNA水平升高[16]；此外，LF还可以刺激IGF-1的翻译，从而间接的促进成骨细胞的增殖和分化[17]。

3 促进骨健康的免疫调节机制

成骨细胞和前体破骨细胞既可以由同一种细胞受不同活化因子的影响而产生，也可以由不同细胞受不同活化因子的影响而产生。如图1所示，核因子κB受体活化因子配体（RANKL）可以诱导T细胞、成骨细胞、骨细胞和滑膜成纤维细胞形成前体破骨细胞；白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子（TNF）可以诱导滑膜成纤维细胞和巨噬细胞形成前体破骨细胞。同时T细胞在受到白细胞介素-22（IL-22）的影响时可以转化为成骨细胞。肝配蛋白B2可以使前体破骨细胞向成骨细胞转化，因此活化因子的类型尤为重要。研究表明LF具有调节获得性免疫的能力，特别是LF的摄入阻止免疫细胞在炎症位点的补充和激活。LF可以降低RANKL和TNF等因子的表达，同时还可以提高IL-22的表达。表明LF可以通过调节活化因子的表达量来间接的促进骨健康[18]。

Jillian Cornish通过鼠骨髓培养评价LF对破骨细胞发展的作用，当用浓度为10μg/mL或更高浓度的LF处理细胞时，新形成的破骨细胞数量明显地降低，当LF浓度达到100μg/mL时，破骨细胞形成完全停止。为确定LF可以作用于哪个阶段破骨细胞，在试验开始或者第二天将LF添加到细胞培养基中，结果发现这两种形式的LF添加都可以降低破骨细胞形成，这就表明LF可以作用于前破骨细胞和成熟破骨细胞，但是LF对于分离出的成熟破骨细胞的骨吸收活性没有影响。鉴于LF对于破骨细胞形成的抑制，通过成骨细胞和骨髓细胞RANKL和OPG的表达来研究LF的作用。LF的可以使成骨细胞OPG转录提高，降低RANKL的表达，当作用于骨髓细胞时，OPG mRNA水平在96 h时才有所上升，而RANKL mRNA水平在96 h有所下降，可以部分解释抑制破骨细胞形成[4]。

图1 骨免疫交联调节成骨和破骨细胞的分化及活性

雌激素具有抑制目标T细胞产生TNF-α的能力，因此能够阻止破骨细胞重吸收和预防骨流失。绝经期或卵巢切除都会使体内缺乏雌激素，进而使得骨白细胞数量增多，并且激活抗原呈递细胞（APC）和T细胞。T细胞激活增加破骨细胞因子如NF-κB配体激活剂受体（RANKL）、提高啮齿动物及人类破骨细胞的分化、成熟、激活和寿命并且使得免疫系统的前炎症因子产生增多，TNF-α促进骨髓基质细胞产生RANKL，并诱导骨髓细胞中的前炎症因子的分泌[19]

，结果导致微环境中刺激产生和释放多种炎症因子，这就使得破骨细胞骨吸收活性增强，导致骨质疏松的发生。研究发现，给予卵巢切除的大鼠LF后，可以降低一些溶骨因子如TNF-α和IL-1β的分泌，抑制炎症因子对骨的分解作用，表明LF具有抑制破骨细胞的作用[4]。

Dorit Naot等用LF处理MC3T3-E1细胞，结果表明用LF处理2 h，IL-6的表达量达到最高值，22 h后又下降到基本水平。当用50μg/mL的 LF处理MC3T3-E1细胞2 h使得IL-6的mRNA增加了35倍，10μg/mL LF处理使其mRNA增加了5倍，表明IL-6的表达和LF呈剂量关系，并且可以快速地增加，呈现出瞬间的变化。同样的方法处理鼠和人初级成骨细胞表现出同样的效果。IL-11功能上与IL-6相关，都具有影响骨细胞增殖和分化的作用。使用实时PCR通过检测经LF处理过的成骨样细胞的cDNA的方法来衡量IL-11的表达量，IL-11在前体成骨细胞培养中可以快速增加，在鼠前体细胞中，LF处理2 h使得IL-11增加了6倍，在人前体细胞中LF处理8 h则使得IL-11增加了70倍。LF使得这些免疫因子的增加，间接的促进了成骨细胞的增殖和分化[20]。

4 抑制破骨细胞形成

破骨细胞是专门负责骨重吸收的细胞，破骨细胞高活性涉及到骨流失症状，如骨质疏松和溶骨症。破骨细胞来源于单核巨噬细胞家族，特征是可以在细胞表面表达CD14。CD14是脂多糖受体，其主要生物学活性是作为脂多糖受体，识别、结合脂多糖或脂多糖复合物，介导细胞反应。CD14刺激细胞分泌TNF和IL-1等诱导破骨细胞形成的细胞因子，LF通过和脂多糖结合蛋白竞争来抑制脂多糖与CD14的相互作用[21]。体外研究发现，通过向培养鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的培养基中添加NF-κB受体活化因子配体（RANKL）可以诱导该细胞分化成破骨细胞。LF在抑制RANKL方面存在剂量关系，RANKL诱导破骨细胞生成不依赖于成骨细胞的存在[22]。另外，LF还可以降低兔破骨细胞和骨细胞混合培养时破骨细胞的骨吸收活性。与LF抑制破骨形成效果对比，LF不能影响分离获得的成熟破骨细胞的骨吸收活性。虽然LF不影响完全分化的破骨细胞的骨吸收活性，但它通过降低新破骨细胞形成的数量来降低其骨吸收[23]。

Anne Blais[24]等人使用绝经后动物模型评价饮食中LF对骨代谢的作用时发现，LF对成骨细胞分化的增强是与破骨细胞分化的抑制相关联。

5 乳铁蛋白状态对成骨作用的影响

5.1 不同铁饱和度LF对成骨细胞增殖作用影响

不含铁的（apo-）和铁饱和（holo-）的LF对成骨细胞有丝分裂活性几乎没有影响，然而却对成骨细胞增殖作用有着很大的不同。Wang等观察到在体外LF刺激成骨细胞增殖活性随铁饱和度增加而降低，进一步动物实验研究表明，对4周龄的ICRswiss雄性鼠连续5天每天在头盖骨皮下注射2次总剂量为4 mg/kg的LF，骨组织形态测定表明新骨形成趋向apo-LF比holo-LF效果好[25]。

Rulan Jiang等通过胸苷嘧啶插入试验，同样得出了apo-比holo-LF促进成骨细胞增殖效果好的结论，该研究使用针对乳铁蛋白受体的功能阻断性抗体抑制剂（U 0126）后，发现会导致apo-LF诱导细胞增殖受到抑制作用，而PI3K抑制剂明显降低apo-和holo-LF诱导的增殖。尽管apo-和holo-LF都可以上调细胞周期素D1（ERK1/2和信号的效应物）的转录，只有apo-LF能够开始ERK1/2信号途径，而apo-和holo-LF都能激活PI3K激酶信号途径。功能阻断LFR和LFR siRNA抗体抑制apo-LF诱导ERK1/2信号途径的激活，表明LFR是涉及到apo-LF诱导的ERK1/2的激活，但不能激活PI3K信号途径，apo-和holo-LF存在着不同的途径使细胞增殖[5]。不同铁饱和度的LF之间的构象差异可能是引起他们之间对成骨细胞增殖活性不同的原因。通过荧光光谱和圆二色谱检测发现当铁饱和度增高时，使暴露的色氨酸增多、α-螺旋增加但β折叠下降[25]。

5.2 不同浓度和不同形式LF对成骨细胞增殖作用影响

HOU等人的研究发现，在用bLF处理成骨细胞室，bLF的浓度为10μg/mL时，能显著地抑制成骨细胞的凋亡，然而，当bLF浓度为1 000μg/mL时，不仅没有抑制细胞凋亡，反而会促进成骨细胞凋亡。这些结果表明bLF有效地抗凋亡作用，然而高浓度bLF对细胞有毒害作用[16]。

J.Cornish等人用重组N-糖苷酶F在室温下过夜处理bLF，使其去糖基化，采用阳离子交换法收集去糖基化的bLF，通过去糖基化与未去糖基化bLF对鼠初级成骨细胞胸苷插入的方法来比较去糖基化bLF对成骨细胞增殖作用的影响，结果表明去糖基化的bLF比未去糖基化的bLF增殖作用显著[26]。

5.3 不同环境和来源LF对成骨细胞增殖作用影响

LF与糖的相互作用可能降低或者破坏一些蛋白质的生物学活性，如免疫调节功能。葡萄糖的加入使得LF对成骨细胞增殖活性降低显著。其原因可能是由于结合糖后使得LF的构象发生变化因而引起了其生物学功能变化[19]。重组人乳铁蛋白与天然人乳铁蛋白的序列一致，说明重组hLF与天然hLF具有相似或相同的生物活性。在人乳铁蛋白转基因小鼠中，进入体内的人乳铁蛋白已被免疫系统所承认，而不被认为是侵入体内的抗原，而与天然乳铁蛋白比较，重组人乳铁蛋白在经过成人胃肠道后几乎被完全降解，而天然牛乳铁蛋白仅降解了40%左右。重组乳铁蛋白糖链中含较高的甘露糖残基，特别是真菌表达系统，使重组蛋白半衰期缩短，对比胰蛋白酶对hLF和bLF的降解表明，hLF的抗性大约是bLF的100倍。这种不同是由于糖基化位点的不同，在bLF中，Asn281的糖基化比Lys282糖基化能更有效地抵抗降解[27]。糖基化不同的LF之间对成骨细胞增殖、分化和抗凋亡作用也存在着差异。

6 小结

LF可以通过抑制成骨细胞凋亡、促进成骨细胞增殖和分化以及免疫调节的方式来促进成骨细胞量的增多，同时LF可以抑制破骨的形成，总体上使成骨细胞数量增多，破骨细胞数量减少，使二者比例增多，进而促进了骨的健康。研究乳铁蛋白对成骨细胞增殖及破骨细胞抑制有利于对骨健康的了解，对今后预防及治疗骨疾病提供了一个新的方向。