抗真菌植物乳杆菌的筛选及其抗菌因素的研究

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

0 前言

12株植物乳杆菌为研究对象，采用双层平板法对12株植物乳杆菌抗真菌特性进行了初步评价，并对其无菌上清液在不同温度和蛋白酶处理条件下的抑菌效果进行了分析。

1 材料及方法

1.1 菌株及来源

实验中所用的12株植物乳杆菌保藏于内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种保藏库(LABCC)，菌株及来源见表1。实验中采用的6株用于植物乳杆菌抑菌试验检测的指示真菌的名称及来源见表2。

1.2 实验所用培养基及试剂

1.2.1 培养基

乳酸菌活化及筛选培养基：MRS broth（OXOID，CM 0359）；MRSagar（OXOID，CM 0361）。

指示真菌培养基：Potato Dextrose Agar(PDA,Oxoid,CM 0139)。

1.2.2 试剂

PBS溶液，2 mol/L NaOH；胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K购于大连宝生物工程有限公司。

表1 实验所用菌株及来源

表2 指示真菌

1.3 仪器与设备

冷冻离心机（5810R型，德国Eppendorf公司），台式高速离心机（TGL-16B型，德国Eppendorf公司），全自动高压蒸汽灭菌器（HA-300M，日本Hirayama公司），恒温水浴锅（HWS28型，上海一恒科技有限公司），电热恒温培养箱（DHP-9272型，上海一恒科技有限公司）BCD-245D型冰箱（青岛海尔股份有限公司），12001型电子天平（上海天平仪器厂），HPS-250型生化培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器厂制造）；雷磁PHS-3C pH计（上海精密科学仪器有限公司），SW-CJ-2FD洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 抑真菌植物乳杆菌的筛选

采用双层平板法[8]（di-layer medium method）对菌株进行筛选，固体MRS作为下层培养基，待其凝固后，滴入3μL处于对数生长期的植物乳杆菌发酵液，于37℃培养24 h，每株菌做3个平行。真菌发酵液（106CFU/mL，OD 600=0.5）与半固体PDA培养基（琼脂0.75%）混合后，作为上层培养基。24℃好氧条件下培养5 d，观察抑菌圈大小，结果取平均值，分别以（-）（无抑制作用）；（+/-）（直径＜1 mm）；（+）（直径1-3 mm）；（++）（直径＞3 mm）表示。

1.4.2 发酵上清液抑菌活性的测定

测定植物乳杆菌发酵上清液的抑菌活性时，采用琼脂孔扩散法[9]（Well-diffiision Agar Assay）。以真菌作为指示菌，在含有真菌孢子悬液的固体培养基上打孔，每孔中加入100μL植物乳杆菌无菌上清液，于4℃冰箱中扩散2 h后置于24℃恒温培养3～5 d。当空白对照平板长满真菌时，测量各样品抑菌圈的大小（保留两位有效数字）。

1.4.3 植物乳杆菌无细胞上清液抑菌活性的测定

将菌株于37℃培养18 h后离心（8 000 g，20 min，4℃），上清液过滤（0.22μm）。将过滤后的无菌上清液置于-80℃10 min，取一部分无菌上清液进行如下处理：用2 mol/L NaOH中和菌液至p H=6.5。接下来，对每种中和的上清液进行如下酶促和热处理，分别加入胃蛋白酶（1 mg/mL），胰蛋白酶（1 mg/mL）和蛋白酶K（1 mg/mL），37℃敷育1 h，未进行酶促处理的p H=6.5的无菌上清液为空白对照[10]。

另一部分无菌上清液用于温度处理：在80℃敷育1 h，100℃敷育1 h，以未作任何处理的植物乳杆菌无菌上清液为空白对照[11]。

以上实验均运用琼脂孔扩散法来测定菌株对真菌的抑菌活性。抑菌圈大小分别以（-）、（+/-）、（+）和（++）表示。

2 结果与分析

2.1 抗真菌植物乳杆菌的筛选

以6株真菌为指示菌，采用双层平板法由12株植物乳杆菌中筛选出对指示真菌抑菌效果较好的菌株，结果取平均值。结果显示，92%的受试菌株对扩展青霉有较强抑制作用，超过一半的菌株对黄曲霉、串珠镰刀菌、产黄青霉、芽枝状枝孢具有抑菌效果，仅有IMAU 40082和IMAU 60047对黑曲霉产生微量抑菌作用。具体结果如下（表3，图1）。

表3 12株植物乳杆菌对指示真菌的抑制结果

2.2 植物乳杆菌发酵上清液抑菌活性的测定

为了表征植物乳杆菌的抗真菌活性化合物，通过琼脂扩散法进一步研究植物乳杆菌IMAU80095无菌上清液（CFS）的抑菌活性。将CFS进行物理和化学处理，以排除或证实其抗真菌物质的化学性质。

图1 IMAU80095对6株真菌的抑菌效果

结果显示，胰蛋白酶处理后的无菌上清液与未处理的上清液的抑制能力存在一定差异。经过胰蛋白酶处理的CFS对黄曲霉、串珠镰刀菌、扩展青霉、产黄青霉和芽枝状枝孢具有较小的抑制作用（＜1mm），对黑曲霉则表现为无抑制作用。然而，经过胃蛋白酶和蛋白酶K处理的CFS与未处理的上清液的抑制能力完全相同，对6株真菌并无抑制。同样，热处理对抑制生长具有影响，高温处理后的CFS（80℃，1 h和100℃，1 h）完全丧失抑菌作用，未作处理的无菌上清液明显有抑菌圈。实验还证明，该化合物对p H的变化较敏感，无菌上清液在未调pH（酸性pH）下显示出明显的抗真菌活性，在将pH调至6.5时，抑菌活性降低，丧失了其拮抗性质。

表4 IMAU80095发酵上清液抑制6种真菌活性结果

3 讨论

丝状真菌是广泛存在的食品腐败微生物，其在食品工业中造成重大经济损失，并且由于其潜在的产霉菌毒素的能力而与食品安全问题有关[12,13]。在过去的几年中，人们开始广泛地研究乳酸菌的抗真菌特性，乳酸菌也被添加到了食品中作为生物防腐剂使用[14]，这一措施有效的避免了由于物理防腐和化学防腐而带来的不利影响。研究表明，植物乳杆菌已成为乳杆菌属中抗真菌领域的重要参与者[15]，对多种真菌均具有抑制作用。

本研究中选用的12株植物乳杆菌分离自内蒙古、青海省、四川省等5个地区，分离于发酵乳、泡菜、曲拉等发酵制品中；6株指示真菌也均分离于燕麦、水果、干酪等食品中。研究中的每株植物乳杆菌对于指示真菌表现出较大的差异，其中，植物乳杆菌能够较大程度的抑制串珠镰刀菌、扩展青霉、产黄青霉和芽枝状枝孢，而对黑曲霉几乎无抑制作用。在Cheong的研究中，有12株植物乳杆菌对曲霉属、青霉属和枝孢菌属的物种显示出抗真菌活性[16]。Magnusson等[17]报道了类似的结果，他分析了1 200株乳酸菌，发现了几株植物乳杆菌对曲霉菌，青霉菌和镰刀菌属具有强抑制活性，但对P.roqueforti不起作用。最近，Crowley等人[18]对约7 000株乳酸菌进行的大规模筛选表明，大多数植物乳杆菌能够抑制扩展青霉的生长。以上研究结论与本实验的结果较为吻合。

乳酸菌抗菌活性一般直接通过含活细胞的菌液来表达，或者由于生长过程中产生的各种活性拮抗代谢物而间接表达。因此，植物乳杆菌分离物含活细胞的菌液表现出广泛的抗真菌活性谱。进一步研究中，采用琼脂扩散法将CFS加入PDA平板中，是建立乳酸菌CFS抗真菌活性的快速方法。植物乳杆菌对真菌的抑制活性在不同的时间内实现，并且由不同的因素引起。早期阶段的抑菌活性是在发酵过程中实现的，是由于菌株在生长过程中产生的代谢产物而产生抑菌效果。研究者将植物乳杆菌的抗真菌化合物纯化，分离出的这些物质有苯乳酸、蛋白质和脂肪酸等。晚期阶段，在细胞生长结束时发现，肽化合物的释放也可能对真菌产生抑制作用，因为细胞自溶是所有菌株常见的特征。

在研究植物乳杆菌IMAU 80095的活性抗真菌化合物时发现，经过胰蛋白酶处理的CFS对黄曲霉、串珠镰刀菌、扩展青霉、产黄青霉和芽枝状枝孢具有较小的抑制作用（＜1 mm），对黑曲霉则无抑制。胃蛋白酶和蛋白酶K处理的CFS对6株真菌并无抑制，与未处理的上清液的抑制能力完全相同。目前，有很多研究发现了对真菌和酵母具有抑制作用的蛋白类物质，它们的数量远低于对细菌有抑制作用的蛋白类物质，如各种细菌素等[19]。最初的研究发现，利用蛋白酶对乳酸菌发酵上清液进行处理会造成抑真菌特性的损失，后来通过进一步研究更加深入的了解了这些蛋白质的特性[20]。这一结果与本实验接近。同样，热处理对植物乳杆菌上清液抑制真菌生长具有影响，本实验中，高温处理过的CFS完全丧失抑菌作用，未作处理的无菌上清液明显有抑菌圈。热处理可能会对上清液的抑菌物质造成影响进而引起菌株抑菌能力的丢失。实验还发现，IMAU80095的活性抗真菌化合物对pH的变化较敏感，将pH调至6.5时，抑菌活性明显降低，证明其抑制能力可能与低p H的有机酸相关，这些有机酸可能为苯乳酸、乳酸、醋酸等。

目前的研究由于缺乏分离少量活性代谢物的合适测定方法，大多数化合物仍待鉴定。因此，进一步的研究应致力于发展有效的方法检测抗真菌代谢物的复杂生物系统，控制抗真菌化合物的最佳条件，以使其更好的抑制真菌，保证食品的安全性。