超声波改性酪蛋白后其特性的变化及其在凝固型酸奶凝胶中的应用

赵璞，张书文，刘鹭，逄晓阳，芦晶，吕加平

（中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193）

0 引言

酪蛋白存在于复杂的牛乳体系中，其在牛乳中为含量最多的蛋白质，约占80%～82%[1]。酪蛋白浓度较低时其分子主要以单体形式存在，但牛乳中的酪蛋白分子则通过疏水相互作用、氢键以及离子键等作用而形成胶束结构[2]，因此分离出的酪蛋白几乎不溶于水。酪蛋白是一种含磷蛋白质，与Ca2+结合可以使微粒结构稳定[3]，而这也是酪蛋白在乳中以胶体粒子形式存在的一个原因。酪蛋白具有蛋白质所具有的三大功能特性即水合性质、结构性质以及表面性质[4]。其中溶解性的高低是酪蛋白其他功能特性优劣差异的前提，其他性质的测定都是在酪蛋白溶解后的基础上所进行研究的，因此，选择一种物理方法对酪蛋白进行改性使其溶解性增加则能够更加有利于对其其他性质的研究。改性较变性往往能够使目的蛋白获得更好的功能特性，而超声破碎的方法将电能转化为声能，利用空穴效应使其产生的极高的能量破碎细胞或其他物质[5]。因此相对于化学方法，生物酶法更加安全、简便、可靠。

牛乳除用作生产乳制品的原料还可用于生产功能性配料，如干酪素、乳清蛋白等。因此若能将牛乳及其成分充分利用则可减少近几年频繁发生的“倒奶杀牛”事件的几率。本文通过设计梯度超声处理，并测定超声处理后的酪蛋白的多种功能性质：溶解性、乳化性及乳化稳定性并进行分析，通过粒度的变化以及蛋白质二级结构的变化侧面反应酪蛋白功能特性的变化原因。另外，本文将超声处理后的酪蛋白应用于凝固型酸奶凝胶的制作中，发现其可提高酸奶的凝胶性质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪蛋白胶束粉（实验室）；脱脂乳粉（新西兰进口）；大豆油（市售）；乳酸菌酸奶发酵剂（丹麦进口）；丙烯酰胺、过硫酸铵（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；四甲基乙二胺（美国aMResco公司）；考马斯亮蓝R 250（北京广达恒益有限公司）；蛋白质Marker（天根生化科技有限公司）；SDS（美国Sigma公司）等。

1.2 仪器与设备

YP2001N型电子分析天平（上海精密科学仪器）；JY92-IIN型超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器）；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备）；RCT basic型磁力搅拌器（上海京工实业有限公司）；漩涡混合器MVS-1（北京金北德工贸海尔）；DELTA 320 p H计（瑞士梅特勒-托利多股份）；DDS-307型电导率仪上海精科实验仪器有限公司；3K-15离心机（美国Sigma公司）；UV-2300型紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器）；T18型乳化剪切仪（上海京工实业有限公司）；Zetasizer Nano 2S型Zeta-电位仪（英国马尔文仪器公司）；MOS-450/AF-CD型圆二色谱分析仪（法国Bio-Logic公司）；FluorChemFC2凝胶成像系统（美国Alpha公司）；TA-XT2i型质构仪（英国Stable Micro System公司）；EPS301电泳仪（美国GEhealthcare公司）；脱色摇床TS-1（Orbital shaker）。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白溶液的配制

从牛乳中分离出的酪蛋白具有胶束状结构，其溶解性极低，实验证明，0.5%即为其饱和溶液。但由于其在牛乳体系中浓度约为3%，且0.5%的浓度过低，对工业生产应用起到的效果并不显著，因此模拟牛乳体系配制3%的酪蛋白溶液。

1.3.2 超声波梯度处理酪蛋白溶液

根据前人实验的经验值[6]设定实验梯度，分别取100 mL、3%的酪蛋白溶液在相同时间5 min作用下，进行200，400，600，800四个不同功率的处理；同样，在相同功率400W条件下，进行5，10，15，20四个不同时间的处理。采用超声间歇工作模式（工作6 s，间隔停歇4 s）。将处理好的酪蛋白溶液于4℃保存，检测前恢复至室温。为保证处理温度不因超声处理过程中所产生大量的热而达到酪蛋白变性的温度，因此处理过程中加以冰浴。

1.3.3 p H和电导率的测定

分别用pH计和电导仪进行超声处理后的酪蛋白溶液pH值和电导率的测定并记录，温度为室温。

1.3.4 溶解性的测定

参考Carr A J[7]的方法，将其进行改进如下：取

1.3.2 超声处理样品冻干后配制成5%的溶液，分别取10 g溶液于50 mL离心管中，配平后于24℃条件下，转速8 000 r/min离心15 min。离心后迅速将上清液取出至10 mL离心管中，取上清液2 g（m0）置于已恒重的平板（m1）中，同时称取未离心原样2 g于预先恒重的平板（m2）中，将平板同时于105℃烘箱中烘干2 h直至恒重，取出后于干燥器中冷却至室温并称重（m3，m4），之后按照下式计算溶解性。

1.3.5 乳化性和乳化稳定性的测定

用浊度法[8]测定乳化能力（EAI）和乳化稳定性（ESI）。取9 mL、3%酪蛋白溶液与3 mL大豆油混合，13 500 r/min乳化2 min，立即从烧杯底部取出50μL乳状液与5 mL、0.1 g/100 mL的SDS溶液混合，500 nm下测定吸光值A0，静置30 min后按相同方法测定乳状液吸光值A30。按照下式进行计算并分析结果。

其中:T=2.303;N为稀释倍数;c为乳状液形成前蛋白质量浓度，g/mL;ψ为乳状液中油的体积分数。

1.3.6 粒度的测定

利用Zeta-电位仪来测定酪蛋白溶液中颗粒粒径的大小，将样品浓度稀释至0.1%后于该仪器中测定溶液颗粒粒径。

1.3.7 圆二色谱分析二级结构变化

将超声处理后的酪蛋白溶液加入0.1 cm厚的椭圆形比色皿中，以去离子水作为空白，测定后通过CDPro软件分析得到酪蛋白二级结构的具体组成以及各组成的含量变化。

1.3.8 凝胶的形成及TPA性质的测定

1.3.8.1 凝胶的形成

在经过超声处理的浓度为3%的30 mL酪蛋白溶液中分别添加脱脂乳粉3.3 g，使其非脂固形物含量为10%，磁力搅拌15 min，90℃水浴杀菌10 min，冷却至室温后，添加0.1%直投式乳酸菌（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）即0.03 g，混匀后放于45℃水浴锅中前发酵6 h，拿出后放于4℃冰箱中冷藏14 h进行后熟备用。

1.3.8.2 凝胶TPA性质的测定

选择P0.5R的探头，测前、测中、测后速度均为1.0 mm/s，感应力设为5 g，测试距离为10 mm[9]；将制作好的酸奶凝胶于质构仪下进行TPA的测定，得出数值后，按照软件中公式进行粘附性、弹性、凝聚性、回复性等性质的计算与分析。

1.3.9 数据处理

各实验重复2次，数据在p＜0.05水平上的显著性采用IBM SPSS 22.0统计软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 超声波对酪蛋白pH与电导率的影响

400W超声处理不同时间酪蛋白pH和电导率的变化结果如表1和图1所示，不同功率超声处理5 min酪蛋白该性质的变化结果如表2和图2所示。

p H值可以直观的反应出溶液的酸碱性，牛乳的p H值一般为6.6左右[10]，而酪蛋白胶束溶液的p H值则在7.0左右，偏弱碱性。如表1所示，超声处理酪蛋白溶液后其pH较未超声处理的酪蛋白有不同程度的提高，但统计学上并不显著。电导率能够反应溶液中离子导电性的强弱，而由图1可看出电导率呈下降的趋势，这与pH不同程度的升高所带氢离子浓度降低结果一致。而溶液黏度的增加也可使电导率下降[6]。

表1 400W超声处理不同时间酪蛋白pH值的变化结果

表2 不同功率超声处理5 min酪蛋白该性质的变化结果

图1 400 W超声处理不同时间（a）以及不同功率超声处理5 min（b）溶液电导率的变化

2.2 超声波对酪蛋白溶解性的影响

溶解性是蛋白质功能性质的前提和基础，其结果可为酪蛋白其它功能性质的变化做理论依据。400 W超声处理不同时间酪蛋白溶解性的变化以及不同功率超声处理5 min酪蛋白该性质的变化结果如图2所示。结果表明，不同条件超声处理酪蛋白溶液其溶解性均增加。400 W超声波处理酪蛋白溶液，5 min处理后溶解性即有显著性的升高（P＜0.05），随着时间的延长，溶解性增加并趋于平缓，而不同功率超声处理5 min后溶液的溶解性基本呈线性增加，这与孙彦君[6]等人研究的超声处理MPC70（乳蛋白浓缩物）的结果一致，可能是由于超声波的空穴效应产生的能量使得蛋白质的亲水性氨基酸从内部暴露，增加了与水的相互作用从而增加了酪蛋白的溶解性[11]。而Wang等人[12]用超声处理蛋白质溶液，发现可明显提高蛋白质的亲水性和溶解性，并解释为是由于超声使蛋白分子分解，并使蛋白质悬浮液乳化所造成；而超声波的机械效应使得酪蛋白颗粒粒径减小，也可增大其与水的接触面积从而增加了酪蛋白的溶解性。

图2 400 W超声处理不同时间（a）以及不同功率超声处理5 min（b）溶液溶解性的变化

2.3 超声波对酪蛋白乳化性和乳化稳定性的影响

乳化性是衡量蛋白质功能的性质之一，它能够表现出蛋白质与油相的结合能力。400 W超声处理不同时间酪蛋白乳化性等的变化以及不同功率超声处理5 min酪蛋白该性质的变化结果分别如图3和图4所示。结果表明，随着时间的延长和功率的增加，超声处理后溶液的乳化性呈增加趋势并具有显著性（P＜0.05），而乳化稳定性虽有下降现象，但整体仍有增强的趋势。可能的原因是，酪蛋白由于其本身的结构特点，肽链上高度亲水区域和高度疏水区域是相对分开的，故酪蛋白本身是一种很好的乳化剂；超声处理后溶液的溶解性增强，而乳化性等与溶解性成正相关[2]，故其乳化性和乳化稳定性均呈增强趋势。

图4 不同功率超声处理5min酪蛋白溶液乳化性及乳化稳定性的变化

2.4 超声波对酪蛋白粒度的影响

溶液中分子粒度的变化可用来解释一些蛋白质功能性质的变化原因。400W超声处理不同时间酪蛋白溶液粒径的变化以及不同功率超声处理5min酪蛋白溶液粒径的变化结果如表3所示。结果表明，用200W的功率或400W超声处理5min后溶液的粒径便由原来的10.112μm显著减小到0.3μm左右，而随着处理时间或功率的增加，粒径也有所减小，但趋于平缓。可能的原因是超声波的机械剪切力使得酪蛋白胶束破坏从而使其粒径减小[13]。从粒径分布的角度来看，样品粒径由未处理的10～100μm降至0.1～1μm，由此可知，超声处理后的样品粒径分布范围显著减小。

表3 不同条件超声处理对酪蛋白粒径的影响

2.5 圆二色谱法分析酪蛋白二级结构的变化

利用圆二色谱仪测定酪蛋白二级结构的变化，通过分析其变化大小判断超声对其结构的影响，结果如表4所示。酪蛋白二级结构中β-折叠和无规则卷曲所占比例最高，分别占36%和33%，而α-螺旋结构比例最少约为4%，这与石燕等人[14]的研究结果较为一致，但各结构的含量有些差别，这可能与样品制备、处理检测方法不同有关。α-螺旋结构经超声处理后其所占比例减少，可能是超声波空穴作用产生的局部高温影响的[15]。也可能是超声波处理后酪蛋白分子中的螺旋结构部分展开，使得蛋白质分子柔顺性增加，而这也可能是酪蛋白乳化性改变的内在因素[14]。其他结构中，β-折叠与β-转角结构无显著变化，而无规则卷曲结构有一定的变化但并无明显规律。从冯景丽[16]等人的电镜结果来看，造成的原因可能是超声波破坏的是酪蛋白胶束，使胶束解离，但未涉及到二级结构的破坏。

表4 不同条件超声处理后酪蛋白二级结构的变化

2.6 超声波处理酪蛋白对其在凝固型酸奶凝胶中的影响

蛋白质的胶凝特性是蛋白质功能特性中一个重要的性质，胶凝性能的提高可以为其带来更多工业上的应用，如乳蛋白制作成的涂料、油漆等。超声处理酪蛋白后其所制作的酸奶凝胶与未处理蛋白样品制作的凝胶TPA性质对比如图5和图6以及其他凝胶性质如表5所示。

质构仪中的TPA模式可以测定凝胶的柔软度、黏附性、硬度、弹性、凝聚性、回复性等指标，其中弹性与回复性相似，均可以说明物体受到挤压并快速恢复变形的能力，它们与凝聚性的数值均＜1，且越接近于1，凝胶特性越好；柔软度是探头达到一定作用力时下行样品的深度，该值越大说明样品越软；对于凝固型酸奶这一需要面向市场消费群众的消费品，考虑到人食用其的方便性，其硬度越小越好，而凝聚性和黏度则越大越好[17-18]。

随着超声处理时间和功率的增加，酸奶凝胶的黏附性增加，硬度降低，凝聚性和弹性均显著增加而回复性和柔软度并无显著变化。其中以硬度和黏度作为评价标准，则600W、5min以及400W、15min处理的酪蛋白形成的酸奶凝胶质构性质最佳，且优于未处理的酪蛋白溶液配制的脱脂乳粉制作的凝胶的性质，可据此将其应用于凝固型酸奶的制作中。

图6 不同功率超声处理5 min溶液粘附性和硬度的变化

表5 不同条件超声处理后凝胶性质的变化

3 结论

本文通过不同时间和功率的超声处理对酪蛋白进行改性，检测并分析其性质变化原因。结果表明：

（1）随着超声处理中时间和功率的增加，酪蛋白溶液的pH未发生显著变化，呈弱碱性；电导率则呈下降的趋势；酪蛋白功能性质中溶解性、乳化性以及乳化稳定性都有不同程度的提高；溶液粒径显著减小；二级结构并无显著变化。

（2）超声处理影响酪蛋白胶束的大小及酪蛋白各个蛋白之间的作用，超声波空穴效应产生的能量使得酪蛋白胶束解离，降低其胶束大小，并使其中的亲水基团暴露，增加其溶解性，而对酪蛋白二级结构影响较小。

（3）超声处理的酪蛋白形成的酸奶凝胶性能较未处理的有显著提高，且超声600 W、5 min以及400 W、15 min处理的酪蛋白形成的酸奶凝胶质构性质最佳，可据此将其用于工业生产中。