新型Kdo2-lipid A合成菌株构建及其免疫生化活性研究

王碧雯 ， 李颜颜 *，王小元

(1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.食品安全国际联合实验室，江南大学，江苏无锡 214122）

脂多糖 （Lipopolysaccharides，LPS）， 俗称内毒素，是大多数革兰氏阴性细菌细胞外膜的主要组成部分[1-2]。LPS的结构分为2部分：疏水的Kdo2-lipid A 和亲水的多糖长链（Polysaccharides，PS），其在维持细胞外膜渗透性和稳定性上起到重要作用[3]。LPS能被哺乳动物细胞表面的Toll样受体4（TLR4）识别而激活先天性免疫系统、诱导促炎性细胞因子的释放。毒性高的LPS可引起促炎症细胞因子过量释放，引发热休克甚至死亡，而低毒性的LPS或其衍生物能有效激活先天性免疫系统但不会产生过量炎症分子，可作为免疫系统激活剂而被开发成疫苗或疫苗佐剂[4-5]。由于LPS提取工艺复杂、提取中需要用到大量的有机溶剂，如苯酚等，同时LPS分子量大、多糖长链部分结构各异，难以直接检测或定量，在生物免疫学研究及临床试验中有较大局限性。因此，降低LPS毒性、优化LPS结构、简化LPS提取检测步骤成为开发利用细菌内毒素的关键。

Kdo2-lipid A是LPS的生物活性中心和毒性中心，是细菌维持正常生长的最小LPS结构[5]。野生型大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）的 LPS 结构如图1所示，包含双磷酸、6条脂肪酸链的Kdo2-lipid A和一条多糖长链。Kdo2-lipid A与多糖长链的连接是由LPS合成途径中的waaC-waaF基因编码的2个庚糖转移酶WaaC和WaaF催化完成[6]，前人研究利用四环素抗性基因插入waaC-waaF基因簇而使之失活，得到只合成短链LPS，即Kdo2-lipid A的菌株WBB06。Kdo2-lipid A相对分子质量小，具有双亲性，可通过三氯甲烷/甲醇体系简易萃取，并通过薄层层析的方法定量分析，在定性的质谱检测中更易电离、有高灵敏度，在水相体系中也有一定溶解度。因此，在疫苗或疫苗佐剂的开发应用中，Kdo2-lipid A较LPS更有优势。

本实验室前期构建了一株外源基因组成型表达菌HW003[7]，该菌在E.coli W3110的染色体上敲除lacI基因，并lacZ位点中插入Kdo2-lipid A外源修饰基因lpxE（来自弗朗西斯菌株，编码的磷酸基团转移酶LpxE，能够特异性地去除Kdo2-lipid A的C1位磷酸基团[8]）和pagL（来自沙门氏菌，编码的脱酰基酶PagL能够特异性地去除Kdo2-lipid A的C3棕榈酸脂肪酸链[9]），其合成的LPS包含特殊结构Kdo2-lipid A及多糖长链，较野生型W3110的LPS毒性降低。本研究在HW003菌株的基础上进一步精简LPS结构，敲除与糖链中庚糖合成相关waaC-waaF基因，构建了一株无抗性标记、能够直接合成不含多糖长链的、特殊结构Kdo2-lipid A的突变株BW003。随后研究了BW003菌株合成的Kdo2-lipid A的结构、菌株及其Kdo2-lipid A的细胞毒性及菌株相关生化表型，为进一步开发为疫苗佐剂及工业生产菌株奠定基础。

图1 E.coli LPS的结构及相关合成、修饰酶Fig.1 Structure of E.coli LPS and relative synthetic or modify enzymes

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株、质粒和引物 所涉及的实验大肠杆菌和辅助质粒列于表1，所涉及的引物列于表2。

1.1.2 培养基和培养条件 培养E.coli时均用LB培养基（蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，氯化钠 10 g/L，调pH到7.4）；含pKD46或pCP20质粒的菌株在30℃下培养，筛选时需加入50 mg/L氨苄霉素；敲除片段同源重组转化子筛选时需加入30 mg/L卡那霉素；其它菌株均在37℃培养。

1.1.3 工具酶和主要试剂 PCR试剂盒，购买于广州东盛生物科技有限公司；Ex Taq聚合酶，购买于TaKaRa公司。

表1 本研究所使用的菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids in this research

表2 本研究用到的引物Table 2 Primers in this research

核酸染料：GoldView，购买于上海赛百盛基因技术有限公司；核酸电泳 Marker，购买于Fermentas公司。DNA水解酶 I、RNA水解酶A和蛋白水解酶K，购买于上海生工生物工程有限公司。酵母膏干粉和蛋白胨，购买于英国OXIOID公司；Ampicillin和Kanamycin抗生素、L-阿拉伯糖、琼脂糖、琼脂粉，均购买于上海捷瑞生物有限公司；硅胶60薄层层析板，购买于德国默克公司；分析纯级别的氯化钠、三氯甲烷、甲醇等常规试剂，购买于国药集团。DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基、2.5 g/L胰酶、青霉素-链霉素溶液，购买于GIBCO公司；胎牛血清，购买于 Thermo-Hyclone公司；PMA、DMSO， 购买于Sigma-Aldrich公司；细胞培养瓶、细胞培养板，购买于 Corning公司；HEK-Blue hTLR4细胞、Normocin多效抗生素、HEK-Blue筛选液及HEK-Blue检测液，购买于Invivogen公司；THP-1细胞，购买于中国科学院细胞库；所有细胞因子ELISA试剂盒，购买于R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 BW003菌株的构建 基于同源重组和位点特异性重组原理，waaC-waaF基因的敲除采用Datsenko[10]和Cherepanov等[11]报道的方法，敲除过程如图2所示。首先，在E.coli JM109中构建waaC-waaF基因的敲除质粒pBS-CFkan，再由PCR从敲除质粒上将敲除片段扩增出来、纯化、回收。在已构建好lpxE-pagL组成型表达的菌株HW003（W3110△lacI lacZ：：lpxE-pagL）中转入pKD46辅助质粒。HW003/pKD46菌株在L-阿拉伯糖诱导培养、制备成感受态后将敲除片段转入，使其发生同源重组从而敲除目的基因。筛选出正确转化子后，通过高温42℃培养去除pKD46质粒，再在转化子中转入pCP20质粒促使位于kan片段两端的FRT位点发生位点特异性重组，从而去除kan片段。最后通过高温42℃培养去除pCP20质粒，进而得到无抗突变株BW003。E.coli感受态细胞制备方法和转化方法参照Han等[12]报道的方法。

1.2.2 Kdo2-lipid A与LPS的提取与纯化制备Kdo2-lipid A粗样采用Bligh-Dyer萃取法[13]。200 mL过夜培养菌液离心以收集菌体，所得菌体双蒸水洗涤一次后用38 mL三氯甲烷/甲醇/水一相体系（1∶2∶0.8，体积比）重悬菌体，磁力搅拌破碎1 h，离心分相，弃下相固体碎片、取上清液再加入10 mL三氯甲烷和10 mL水，配成三氯甲烷/甲醇/水二相体系（2∶2∶1.8，体积比）；再次离心以分相，将下相液体移至旋蒸瓶，旋转蒸干溶剂，所得粗样-20℃保存。Kdo2-lipid A样品的纯化制备参照Zhou等[14]的DEAE-纤维素阴离子交换层析方法：将BW003的Kdo2-lipid A 粗样溶于 5 mL 三氯甲烷/甲醇/水（2∶3∶1，体积比）溶液，上样于一个事先用6倍体积三氯甲烷/甲醇/水 （2∶3∶1， 体积比） 溶液平衡的、10 mL DEAE-纤维素阴离子交换柱；用三氯甲烷/甲醇/240 mmol/L 醋酸铵（2∶3∶1，体积比）溶液洗脱磷脂等杂质，再用三氯甲烷/甲醇/480 mmol/L 醋酸铵（2∶3∶1，体积比）溶液将Kdo2-lipid A进行洗脱并收集；收集洗脱液配成三氯甲烷/甲醇/水二相体系 （2∶2∶1.8，体积比）；离心取下相，旋蒸除去溶剂，得Kdo2-lipid A纯品，-20℃保存。

图2 W3110，HW003，BW003菌株染色体基因型比对和waaC-waaF敲除示意图Fig.2 Diagrams of chromosomes genotype alignment of strains W3110,HW003,BW003 and the deletion of waaC-waaF

LPS样品的提取采用热酚法[13]。离心菌液收集约5 g湿菌体，用双蒸水洗涤菌体一次后加入18 mL水和22 mL体积分数90%苯酚，68℃震荡1 h；冷却后4℃离心分相，取上相透析24 h以去除苯酚；透析后的溶液经真空冷冻干燥得到LPS粗样。LPS粗样按照Karow等[15]方法，复溶后添加DNA水解酶I、RNA水解酶A和蛋白水解酶K处理去除核酸及蛋白质，真空冷冻干燥后再用三氯甲烷-甲醇混合溶液洗涤以去除磷脂，最后复溶于双蒸水中真空冷冻冻干，得LPS纯品，4℃保存。

1.2.3 Kdo2-lipid A的薄层层析（TLC）分析及电喷雾电离质谱（ESI/MS）分析 薄层层析（TLC）分析及电喷雾电离质谱（ESI/MS）分析均按照Wang等[16]的方法，Kdo2-lipid A 粗样溶于三氯甲烷/甲醇（2∶1，体积比），TLC分析时将样品点于硅胶60 TLC板上，在三氯甲烷/甲醇/冰醋酸/水（25∶15∶2∶1，体积比）的展层剂中层析，层析结束后吹干板上残留展层剂，用乙醇/硫酸（1∶9，体积比）溶液进行碳化，最后加热至180℃显色；ESI/MS分析时，进样于WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer质谱仪，在120 V锥孔电压、负离子扫描模式下检测m/z 1 000～2 500范围的离子，所得数据用MassLynx V4.1 software软件处理分析。

1.2.4 HEK-Blue hTLR4细胞毒性分析 HEKBlue hTLR4细胞是经转染改造的人肾上皮细胞，是在HEK293细胞中表达了人TLR4及NF-kB诱导分泌的胚胎碱性磷酸激酶报告基因，能特异性识别LPS或含有LPS的细菌、实时监测LPS诱导的TLR4免疫通路的强弱，通过显色反应检测出对应样品的TLR4的刺激能力和对细胞的毒性。HEKBlue hTLR4细胞培养参照Needham等[17]的方法和细胞使用说明书。细菌菌体收集后用无热源磷酸缓冲液（PBS）洗2次后梯度稀释，先加入96孔板，无菌PBS作为空白对照；HEK-Blue hTLR4细胞收集计数后用HEK-BlueTM检测液重悬再接种至96孔板；细菌和细胞混合培养12 h后检测OD650的吸光度，吸光度与TLR4信号通路激起的强度成正比。

1.2.5 THP-1细胞的毒性分析 细胞培养参照Li等[18]的方法。细胞收获计数后，按终质量浓度20 ng/mL添加PMA并将细胞悬液接种至96孔板，培养12 h后细胞分化贴壁，倒弃旧培养基，更换新鲜培养基，同时加入质量浓度分别为 100、10、1、0.1 ng/mL的Kdo2-lipid A或LPS纯化样品，以不添加样品的新鲜培养基作空白对照。细胞再培养24 h后离心取培养上清液，保存于 -80℃。用于ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中细胞因子 TNF-α、IL-8和RANTES的刺激释放量。

1.2.6 菌株生化表型分析

1）菌株细胞表面疏水性的测定。参照Del Re等[19]的方法，用PBS洗涤菌体一次并重悬，控制菌悬液OD600=0.5；取3 mL菌悬液置于试管中，再加入1 mL二甲苯，剧烈震荡2 min后静置0.5 h，取下相液体测OD600。

2）菌株外膜渗透性的测定。菌株外膜渗透性测定采用 NPN（N-Phenyl naphthylamine）方法[20]。离心收集菌体，用PBS洗涤菌体一次并重悬，控制菌悬液OD600=0.5；取1.92 mL菌悬液与80 μL 1 mmol/L的NPN溶液混匀于石英比色皿中，测定激发波长350 nm、发射波长420 nm、缝宽5 mm条件下的荧光吸收值。外膜渗透性与荧光吸收强度成正比。

3）菌株自凝集能力的测定。参照Rahman等[21]的方法，离心过夜培养菌液以收集菌体，用PBS洗涤菌体一次并重悬，控制菌悬液OD600≈2.0（记为A0，保留三位有效数字）。取10 mL菌液转移至刻度管，22℃静置 24 h，测定菌液 OD600值（记为 Ai，保留三位有效数字）。

自凝集百分数 AAg%=[（A0-Ai）/A0]×100

4）菌株抗生素MIC值的测定。将新生霉素（Novobiocin）用LB液体培养基倍比稀释，使质量浓度 分 别 为 1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.80、3.90 μg/mL，加入96孔板中，留一排新型LB培养基作生长对照；另将等体积OD600=0.01的稀释菌液加入96孔板中，盖上盖子，37℃静置培养12 h，用酶标仪测定菌液OD600。将OD600小于0.15的点对应的抗生素浓度定义为菌株对新生霉素的MIC值。

2 结果与讨论

2.1 BW003菌株的构建

首先，对出发菌株HW003进行PCR鉴定（图3（a））。以lacZ-F/R（lacZ位点中间位置设计的一对引物）为引物，W3110基因组lacZ位点PCR产物大小为 300 bp 左右（图3（a）的 1 泳道）；HW003 基因组PCR 产物则为 1 996 bp（图3（a）的 2 泳道），电泳结果验证表明出发菌株HW003的lacZ位点中成功插入lpxE-pagL基因。随后，通过同源重组的方法开始敲除waaC-waaF基因，成功敲除后，PCR验证图如图3（b）所示。 图3（b）1 泳道是以 waaC-waaF-F/R为引物，对HW003菌株基因组PCR得到的产物，大小为2 495 bp，是waaC-waaF基因未敲除的大小。泳道图3（b）2泳道是敲除片段同源重组后转化子基因组PCR所得产物，大小为1 668 bp。图3（b）3泳道则是去除kan片段后，BW003菌株基因组PCR产物，大小为635 bp，表明waaC-waaF基因敲除成功。

图3 各菌株lacZ位点和waaC-waaF基因段染色体PCR验证电泳图Fig.3 Verification of lazZ site and waaC-waaF gene by PCR

2.2 BW003菌株合成的Kdo2-lipid A结构鉴定

用已知 Kdo2-lipid A生产菌 WBB06（W3110 waaC-waaF：：tet6）作为对照[6，22]，根据 Bligh-Dyer 萃取法分别提取WBB06和BW003菌株合成的Kdo2-lipid A，样品分别点在硅胶60 TLC板上，层析显色，得图4（a）。根据展层剂性质，样品迁移速度与疏水性成正比，即磷酸基团越少、脂肪酸链越多迁移速度越快。磷脂相对分子质量小、疏水性最强，迁移速度最快，显色于TLC板上方。Kdo2-lipid A则集中于TLC板中部。WBB06粗样只含有单一的、双磷酸、6条脂肪酸链的Kdo2-lipid A，在TLC板上只有1个显色点；而BW003的粗样则呈现出上中下3个显色点，可见BW003合成了3种不同结构的Kdo2-lipid A。根据亲疏水性，推测中间一点为LpxE与PagL共同作用修饰后生成的目标产物-单磷酸、5条脂肪酸链的Kdo2-penteacyl-monophosphate-lipid A（Kdo2-P-MPLA）；而目标产物下方的点与WBB06显色点平齐，则推测同为野生型双磷酸、6条脂肪酸链的Kdo2-lipid A；上方点则推测为LpxE作用，但PagL未作用而生成的单磷酸、6条脂肪酸链的Kdo2-monophosphate-lipid A（Kdo2-MPLA）。

通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）对菌株BW003的粗样进一步进行结构鉴定。质谱结果与TLC分析相符合，BW003菌株粗样在质谱中检测出3个主要的[M-H]-负离子峰，分别是 m/z 1 930、2 156和 2 236，与平均相对分子质量为 1 931、2 157和2 237的Kdo2-P-MPLA、Kdo2-MPLA和 Kdo2-lipid A相对应。结果表明BW003菌株能够直接合成不含多糖长链的、特殊结构的Kdo2-P-MPLA，但同时混有部分Kdo2-lipid A和Kdo2-MPLA。

2.3 活菌刺激HEK-Blue hTLR4细胞的毒性分析

活菌直接刺激HEK-Blue hTLR4细胞后细胞液Abs650的吸光度正比于TLR4信号通路激起的强度。如图5所示，W3110，HW003及BW003活菌体都能有效激起TLR4信号通路；在菌浓度为103～106CFU/mL范围内，三者激起的TLR4信号强弱有明显差别：W3110最高，HW003适中，BW003最低；尤其在104 CFU/mL时，W3110的OD650高达1.02，HW003的OD650降低为0.66，而直接合成特殊结构Kdo2-lipid A的BW003菌株的OD650只有0.48，较W3110降低53%。研究结果表明BW003菌株LPS结构改变后，刺激细胞的毒性比野生型W3110菌株明显下降。

图4 BW003合成的Kdo2-lipid A薄层层析分析与电喷雾电离质谱分析Fig.4 TLC analysis and ESI/MS analysis of Kdo2-lipid A from BW003

图5 E.coli W3110，HW003及BW003活菌体对TLR4信号通路激起的强度比较Fig.5 Comparison of TLR4 stimulation of whole bacterial cells of E.coli W3110，HW003 and BW003

2.4 Kdo2-lipid A刺激THP-1细胞的毒性分析

为进一步研究LPS分子结构的改变对免疫细胞的毒性的影响，纯化后的W3110 LPS、HW003 LPS及BW003 Kdo2-lipid A样品被梯度稀释用于刺激人的THP-1巨噬细胞，并刺激后测定TLR4下游MyD88通路及TRIF通路的促炎症细胞因子TNF-α、IL-8和RANTES的释放量，细胞因子释放量越大说明细胞毒性越高。如图6所示，细胞因子释放量与样品质量浓度成正比，W3110 LPS诱导TNF-α、IL-8及RANTES的分泌量在4个浓度下最高，其毒性最强。而HW003 LPS与BW003 Kdo2-lipid A二者免疫活性接近，细胞毒性均较W3110有明显减弱。在样品质量浓度为100 ng/mL时，W3110 LPS诱导 TNF-α、IL-8及 RANTES的分泌量分别为 2 202，19 347，7 261 pg/mL； 而 BW003 则 只 有 1 563，14 175，5 621 pg/mL， 分别降低了 29%、27%和22%，说明BW003合成的特殊结构Kdo2-P-MPLA，虽然混合了其他2个结构，但较野生型的LPS能够明显减毒，同时也保持了一定的免疫活性，具有开发为新型疫苗佐剂的潜力。

2.5 菌株生化表型分析

以W3110和HW003作为对照，对BW003菌株的表型进行分析测定。由图7（a）可见，表达lpxE-pagL基因后HW003的疏水性较W3110（40%）略有提升，而表达lpxE-pagL基因并敲除waaC-waaF的BW003菌株由于其LPS同时缺失C1位磷酸基团、C3位脂肪酸链和多糖长链，菌株的外膜渗透性则明显升至W3110菌株的3倍，而对照的HW003菌株的外膜渗透性是W3110菌株的1.23倍。更高的外膜渗透性也使得抗生素更容易进入细菌细胞内部发生作用，因此BW003也表现出对抗生素的高度敏感，由图7（b）可见，W3110对新生霉素的MIC为1 000 μg/mL，HW003 略低，为 500 μg/mL，而BW003对新生霉素的MIC则骤降为15.6 μg/mL。另一方面，LPS结构的改变使得BW003菌株的细胞表面疏水性提升至83%（图7（c））。疏水性的增加使得菌株在液体培养体系中更容易聚团、凝集，在静置24小时后，BW003的自凝集比例为93%，而W3110和HW003仅为 23%和 22%（图7（d））。

图7 W3110、HW003及BW003菌株、外膜渗透性、新生霉素MIC、疏水性、自凝集能力的比较Fig.7 Comparison of membrane permeability，Novobiocin MIC，hydrophobicity and auto-aggregation of E.coli strains W3110，HW003 and BW003

3 结语

LPS能被哺乳动物细胞表面的TLR4受体识别激活先天性免疫反应，具有被进一步发展成为新型疫苗或疫苗佐剂的潜力。但LPS前期提取工艺复杂，消耗大量的苯酚，纯化步骤也相对繁琐，且由于LPS相对分子质量大、多糖长链部分结构各异，难以直接检测或定量，在生物免疫学研究及临床试验中有较大局限性。

本研究通过敲除HW003菌株中与多糖长链合成相关的waaC-waaF基因，使得多糖长链无法与Kdo2-lipid A相连接，成功构建一株直接合成新型、特殊结构的Kdo2-lipid A的突变株BW003。该菌株合成的LPS结构发生变化，其合成的新型Kdo2-lipid A可由三氯甲烷/甲醇/水体系简易快速萃取得到，不用消耗苯酚；其纯化步骤也较为便捷可行，通过DEAE离子交换柱梯度洗脱便可实现。Kdo2-lipid A可用TLC和ESI/MS直接分析、便于进行实时定量与检测，能够更好的应用于实验室或临床研究中。

BW003菌株合成的LPS结构定向改变后，菌株的外膜渗透性、抗生素敏感性、细胞表面疏水性及菌体自凝集能力较野生型W3110与HW003，均有一定程度的提高。外膜渗透性的改变加速了细胞内外物质的交换，菌体自凝集能力的增强简化了菌体收集的步骤，为后续在工业化发酵生产菌株的制备奠定了良好基础。

BW003菌株合成的Kdo2-lipid A具有多样性，共包括3种结构：Kdo2-P-MPLA （单磷酸、5条脂肪酸链）、Kdo2-MPLA（单磷酸、6条脂肪酸链）和Kdo2-lipid A（双磷酸、6条脂肪酸链）；其合成产物的多样性是由LpxE和PagL 2个结构修饰酶作用效果不完全所致。新型特殊结构Kdo2-lipid A的存在，使得BW003菌体的毒性显著下降。HEK-Blue hTLR4细胞刺激实验结果表明BW003较野生型W3110的TLR4信号强度降低53%。纯化后BW003合成的Kdo2-lipid A分子刺激THP-1细胞后产生的炎症细胞因子TNF-α、IL-8和RANTES的浓度明显降低，表明Kdo2-lipid A分子较W3110的LPS而言，内毒素毒性减弱。研究结果为进一步探究不同结构内毒素的生物免疫活性、开发相关的新型疫苗及其疫苗佐剂奠定了基础。