油茶籽水酶法制油水相固形物中茶皂素含量测定研究

郭咪咪 薛雅琳 张 东 段章群 王雅朦 朱 琳 李秀娟 李晓宁

(国家粮食局科学研究院, 北京 100037)

中国是世界上油茶分布最广的国家，主要分布在我国南部地区，同时也是油茶籽油生产基地最大的国家，年产量15万t左右。油茶籽中含油量(干基)39.6%～65.3%，提取油茶籽油是合理利用油茶籽的有效途径之一。酶法生物提油(水酶法)是近年来研究较多的一种新型提油工艺，在油茶籽提油中得到广泛应用，其特点在于能耗小、反应条件温和且可以有效保护油脂、蛋白、胶质等可利用成分的品质。水酶法提取的油茶籽油，虽然油中保留了较多的营养成分，但加工过程中副产物水相富集了茶皂素、多糖、蛋白质等物质[1]，有研究报道，水酶法油茶籽油工艺水中茶皂素质量分数5.98%、多糖6.14%、蛋白质5.12%、总黄酮0.047%[2]。直接将水相排放不仅造成资源浪费，还导致水体环境COD超标等问题。如何合理利用副产物，以及如何解决环境问题已成为加工企业生产加工链中首要考虑的问题。目前油茶籽在加工副产物中提取分离具有高附加值的茶皂素、多糖等方面有相关研究报道[3-6]，这不仅增加了副产物利用率、提升油茶籽的使用价值和经济价值，还为油茶籽精深加工、形成产业链等奠定基础。

油茶皂素是皂素中的一类，主要存在于油茶籽仁和壳中，基本结构包括配基、糖体和有机酸，属于五环三萜类皂苷的混合物。目前国内外对茶皂素的研究主要在提取纯化、含量测定和少部分的结构鉴定等方面，但目前对于油茶籽水酶法水相固形物中成分研究分析较少[7-8]。本研究以水相固形物中茶皂素为研究对象，建立一种快速、稳定、准确测定茶皂素含量的液相方法。不仅为充分利用茶皂素资源提供数据参考，还可为更快、更有效的监控水酶法排放液中茶皂素提供技术支持。因此建立适合水相中茶皂素含量快速分析的方法，对水酶法工艺产业链发展是非常重要的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水相固形物(自制：由油茶籽水酶法提油的水相液体喷雾干燥得到的粉末固体物质)；茶皂素标准品(规格99%)：陕西帕尼尔生物科技公司；浓硫酸(分析纯)；香草醛；甲醇(色谱纯)等。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计；1100型高效液相色谱仪(配置紫外检测器)。

1.3 试验方法

1.3.1 茶皂素含量比色法测定

茶皂素标准溶液的配制：精密称取茶皂素标准品10.8 mg，水溶解10 mL容量瓶中定容，得1.08 mg/mL的茶皂素标准溶液备用。

标准曲线制作：准确移取标准溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL分别于10 mL具塞试管中，依次加入蒸馏水0.8、0.7、0.6、0.5、0.3 mL，在冰水浴条件下精确加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，反应5～10 min，然后加入77%硫酸溶液4 mL，摇匀，置于60 ℃水浴中加热15 min后，取出置于冰水浴中冷却约10 min，取出静置至室温。同时做空白样品对照。取0.5 mL标准溶液的显色反应液于1 cm比色皿中，紫外-可见分光光度计全波长扫描，得出最大吸收波长，在最大吸收波长下测定各茶皂素标准工作液吸光度。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。

样品制备：称取水相固形物粉末6.0 mg左右，蒸馏水溶解，10 mL容量瓶定容，取1 mL于10 mL具塞试管，显色反应处理方法同标准曲线测定相同，测定其吸光度。

油茶皂素含量以质量分数表示，计算公式为：

式中：c为由标准曲线计算得到的油茶皂素质量浓度/mg/mL；m为样品质量/mg。

1.3.2 茶皂素含量液相色谱法测定

茶皂素标准工作液的制备：准确称取10.0 mg茶皂素标准品，80%甲醇溶解并定溶于10 mL容量瓶中，即得1 mg/mL的茶皂素甲醇标准溶液。用40%甲醇溶液稀释，依次得到0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL的标准工作液，0.45 μm微孔滤膜过滤，液相色谱分析。

样品制备：准确称取水相固形物粉末5.0 mg于50 mL离心管，加水10 mL，摇匀，超声1 min促进溶解，移取1 mL，加1 mL 40%甲醇溶液，混匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，色谱进样分析。

液相色谱条件[9-10]：色谱柱SUPELCOTM LC-18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：甲醇—0.1%磷酸(体积比40∶60)；流速：0.8 mL/min；检测波长：267 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；分析时间：23 min。因为茶皂素是多种皂苷单体的混合物，所以在色谱图中会显示多个单体峰，以单体峰面积和为茶皂素峰面积，根据标准曲线计算样品中的茶皂素含量。

2 结果与讨论

2.1 茶皂素含量比色法测定

茶皂素含量比色法测定采用香草醛-浓硫酸与皂素的显色反应。其原理主要是：茶皂素中含有皂苷，皂苷是一类含有糖苷键的四环或五环三萜的化合物，其C3、C12上的羟基可与香草醛上的醛基发生反应形成缩醛，成为新的共轭体系而显色，此显色物质在可见光区有明显吸收[11]。

茶皂素标准品与香草醛-浓硫酸显色后，在紫外-可见分光光度计上扫描所得的最大吸收波长为456 nm。与陈莹等[11]报道的最大吸收波长451 nm相接近。在456 nm下测定标准工作液吸光度，以标准工作液浓度为横坐标，各吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图1)，建立回归方程：y=1.275x-0.122 4，R2=0.993 8。可知油茶皂素的浓度在0.2～0.7 mg/mL之间是呈线性关系，且线性关系较好。

图1 茶皂素浓度与吸光度标准曲线

采用香草醛-浓硫酸显色法测定油茶籽水酶法水相固形物中的茶皂素质量分数为60.97%，RSD=3.67%。

2.2 茶皂素含量液相色谱法测定

2.2.1 紫外吸收光谱测定

水相固形物(样品)与茶皂素(标准品)分别水溶解，流动相40%甲醇稀释，考察在190～500 nm下的茶皂素甲醇水溶液的吸收波长。光谱扫描如图2。图2可以看出，茶皂素标准溶液与样品溶液均在267 nm下有最大吸收，且吸收光谱相类似，说明样品具有与茶皂素标准品相似的光谱吸收特性。选取267 nm作为液相的检测波长。

图2 样品与标准品光谱扫描图谱

2.2.2 液相色谱标准曲线及色谱图

以茶皂素标准工作液浓度为横坐标，峰面积和为纵坐标，作标准曲线(图3)，方程：y=179 8.5x-2.591 9，R2=0.999 2。样品、标准品及样品加标的色谱峰如图4。图4可以看出，选用的标准品与样品的色谱峰相同，说明该标准品适合作为样品的标准品进行其茶皂素含量的计算。在液相色谱图中，茶皂素标准溶液和样品溶液会出现2个主要的色谱峰，且两色谱峰面积呈现一定比例关系，且在课题研究过程中发现，不同原料来源的茶皂素，此两色谱峰面积主次不同，与钟世安等[12]报道相同。在本课题优化的色谱条件下，两个色谱峰达到较好的分离，与文献[13]中报道相比，此色谱条件具有更好的分离度，2个主要色谱峰分别在7 min与10 min左右出峰，避开了溶剂峰出峰时间，且经过对液相条件优化后，两色谱峰的对称因子符合对称性要求。表明该方法更适合作为茶皂素液相测定的方法。在作标准工作曲线和计算样品中茶皂素含量时，以两色谱峰的总面积和进行计算。

图3 标准品液相色谱法标准曲线

图4 样品、标准品及加标样品色谱图

2.3 精密度

吸取0.3 mg/mL的标准溶液10 μL注入液相色谱仪，同一色谱条件下一日内连续进样6次，测得的两个主要色谱峰的峰面积和分别为541、541.3、540.2、539.1、540、538.6，以峰面积的相对标准偏差(RSD)为指标，考察仪器的精密度。RSD结果为0.19%(n=6)，表明仪器精密度较好。

2.4 重复性

称取油茶籽水酶法水相固形物样品6份，按照上述液相色谱法样品制备与液相色谱条件操作，记录6个样品的色谱峰面积，结果如表1。RSD结果3.0%(n=6)，表明方法有较好的重复性。在油茶籽水酶法提油后水相固形物中茶皂素平均质量分数54.57%，与分光光度比色法测定结果接近，表明在水相固形物中含有一半以上的物质是茶皂素。因此充分利用水酶法提取油茶籽油的水相副产物，进一步浓缩或干燥制备浓缩液或水相固形物，不仅易于保存运输，而且大量的茶皂素资源可为开发环保型的天然绿色洗涤剂提供重要原料渠道。同时茶皂素的溶血、抗菌、消炎、抗高血压等活性功能，也可使大量的茶皂素资源在农业、工业以及药业等行业得到更广阔的应用前景。

表1 液相法水相固形物中茶皂素含量

2.5 检出限和平均加标回收率

检出限：以40%甲醇为溶剂，将0.01 mg/mL的茶皂素标准品溶液进一步稀释。以基线噪音3倍峰面积对应的样品中茶皂素含量为最低检出限，茶皂素最低检出限约为0.2%。以基线噪音10倍峰面积对应的样品中茶皂素含量为最低定量检出限，茶皂素最低定量检出限约为0.7%。

平均加标回收率：在油茶籽水酶法提油后水相固形物样品中加入不同量的茶皂素标准品，按照本研究中的样品处理方法和色谱条件测定，计算回收率，回收率为90.88%～113.13%，符合方法回收率要求。相关数据见表2。

表2 液相法茶皂素回收率

3 结论

本研究建立的茶皂素液相色谱方法，是以相关报道中常采用的香草醛-浓硫酸显色法测定的水相固形物中茶皂素含量为参考依据，并同时在相关液相测定茶皂素的文献研究基础上改进得到的。该方法平均加标回收率90.88%～113.13%，精密度达0.19%，定量检出限0.67%，测得水相固形物中茶皂素质量分数达54%，与香草醛-浓硫酸显色法测定结果相近，但液相色谱法具有试验易于操作、耗时短、检出限低等特点，且该液相色谱方法能更好的达到分离两个色谱峰、排除溶剂峰干扰等特点，更适合快速、准确地测定水相或预处理的水相中茶皂素含量。