油橄榄叶提取物橄榄苦苷的酶法水解产物及其抗氧化能力的研究

2018-08-20王仲明谢跃杰李园园卢赐强赵富昌黄梅桂

中国粮油学报 2018年7期

王强王仲明谢跃杰李园园王波卢赐强赵富昌黄梅桂

(重庆第二师范学院生物与化学工程学院1，重庆 400067) (重庆第二师范学院脂质资源与儿童日化品协同创新中心2，重庆 400067) (甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心3，兰州 737100) (重庆江源油橄榄开发有限公司4，重庆 401587) (南京林业大学轻工与食品学院5，南京 210037)

橄榄苦苷(oleuropein，OE)及其苷元(aglycon)是一种天然裂环烯醚萜苷类多酚化合物，广泛存在于各种木犀科的木犀榄属、丁香属、女贞属等植物中。20世纪50年代初，OE一直被认为是橄榄油中的一种苦味素；1960年，Panizzi等[1]首次从橄榄油中苦味成分中分离出OE；1970年，Inouye等[2]首次从女贞树提取并纯化了橄榄苦苷，并明确了OE结构，其结构中含有6个羟基(如图1所示)，具有多种药理活性，近年来研究备受关注。

图1 基本结构式

研发发现，橄榄苦苷以油橄榄及其叶中含量最高[3-5]。油橄榄(OleaeuropaeaL.)属木犀科(Oleaceae)

木犀榄属(Olea)常绿乔木，是世界著名的木本油料兼果用树种，栽培品种有较高食用价值。采用油橄榄提取橄榄苦苷及其苷元成本太高[3-4]。研究发现油橄榄叶含有的抗氧化活性成分较之橄榄油更为突出，主要有橄榄苦苷、羟基酪醇(hydroxytyrosol，HT)、黄酮类、木酚素类和咖啡酰苯乙醇苷类等多酚类化合物[3-7]；油橄榄叶提取物早已被地中海地区的人们当作民间医药来治疗发烧和其他疾病如疟疾等[8]，油橄榄叶提取物具有强的抗氧化活性和抑菌活性[9]。研究表明，油橄榄叶中含有丰富的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗肿瘤和降血糖等活性，并逐渐应用于医药、保健食品、化妆品等行业且应用前景广阔[8-12]。

我国甘肃陇南、重庆奉节、四川广元等地均大力推广油橄榄种植，在油橄榄果生长过程中，会产生大量的副产物——油橄榄叶，每年每棵油橄榄树修剪过程就要产生超过25 kg的嫩枝和树叶。虽然国外已有将油橄榄叶提取物用于食品、药品和化妆品等行业的报道，国内也有一些将橄榄叶加工成茶饮料、油橄榄叶挂面等报道，但均直接利用原料叶或粗提物；对如何有效提取分离油橄榄叶中裂环烯醚萜类化合物，拓展该类化合物的应用范围，还有待进一步研究。油橄榄叶中橄榄苦苷的提取方法通常有酶提取法、醇浸提法、索氏抽提法、微波辅助提取法、超临界CO2萃取法等，但是均对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷及其水解产物的组成未知[13-18]。本实验通过在橄榄苦苷提取的过程中添加各种水解酶，探索水解酶对提取过程及其水解产物的影响机制，在此基础上，分析油橄榄叶提取物中橄榄苦苷及其水解产物的组成和抗氧化能力，以期对油橄榄叶有效综合利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试油橄榄叶：从重庆奉节县油橄榄种植基地采集(实验采用完全随机设计，选取不同株生长健壮、长势一致的生叶为试材，均为成熟叶，即非嫩叶或老叶)；

橄榄苦苷、羟基洛醇对照品(纯度≥98%)：成都曼思特生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、维生素C(VC)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚

(BHT)、β-葡萄糖苷酶(A. niger)(100 U/mg)、β-葡萄糖苷酶(来自杏仁)(100 U/mg)：美国Sigma-Aldrich公司；半纤维素酶(A. niger)(1.5 U/mg)：北京索莱宝科技有限公司；木瓜蛋白酶(100U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg)、中性蛋白酶(100U/mg)：诺维信(中国)生物技术有限公司；纤维素酶(45 U/mg)：阿拉丁试剂(上海)有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

JYL-C012Joyoung/九阳料理机；高压均质机；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱、DK-8D三孔电热恒温水槽、722S 型可见分光光度计；PHS-3C型pH计；KH-5200DE 型数控超声波清洗器。

1.2 实验方法

1.2.1 油橄榄叶处理方法

蒸馏水清洗，室内自然阴干，60 ℃干燥，粉碎过40目筛，于4 ℃保存备用。

1.2.2 油橄榄叶中橄榄苦苷的提取

定量称取1.0 g油橄榄叶干燥粉末，加入40 mL甲醇水溶液(甲醇与水的比例为4∶1，V/V)，搅拌群均匀后，置于超声波清洗器中超声提取24 h；冷却至室温，离心(1 500×g，15 min)，取上清液，过0.45 μm滤膜，计算油橄榄叶中橄榄苦苷提取率[15]。

1.2.3 酶法水解

选取木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶(A. niger)、β-葡萄糖苷酶(来自杏仁)、半纤维素酶(A. niger)、纤维素酶7种酶，称取相同酶活力(1.5 U/mg)的各种酶均在最适温度和pH条件下进行酶解实验(即将酶分别加入“1.2.2”实验过程中)。分别于1、2、4、6、8、10、12 h将酶解体系放置于-20℃条件下终止酶解反应，分析各酶解阶段的酶解率及产物组成。

酶解率=(m橄榄苦苷水解前-m橄榄苦苷水解后)÷m橄榄苦苷水解前×100%

1.2.4 LC-MS/MS产物组成分析

色谱条件：色谱柱为UPLC BEH C18(50 mm × 1.0 mm, 1.7 μm)；流动相：A为0.2%(V/V)甲酸乙腈， B为0.2%甲酸水；流速0.15 mL/min；进样量：2.0 μL；柱温35 ℃。质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，在负离子电离模式下选用MRM扫描方式进行质谱测定；毛细管电压4 kV，喷雾压力5 kV，辅助加热气：氮气，流量 8 L/min；加热温度：300 ℃；其他质谱条件见表1。

表1 LC-MS/MS分析橄榄苦苷水解产物的定性和定量参数

1.2.5 油橄榄叶提取物水解前后的抗氧化能力的半数抑制质量浓度(IC50)测定

1.2.5.1 铁离子还原法(FRAP) 参考Iris等[20]报道的方法。取100 μL提取物，加1.8 mL TPTZ工作液[由0.3 mol/L醋酸盐缓冲液25 mL(pH 3.6)，10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL组成]，混匀后37 ℃反应15 min，测定吸光度A593 nm，以1.0 mmol/L FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示。

1.2.5.2 清除DPPH自由基(DPPH·)的测定参考Liu等[21]方法进行，将4 mL的95%DPPH·乙醇溶液(10-4mol·L-1)与提取物500 μL混匀后测定吸光度A517 nm，采用IC50评价橄榄苦苷及其水解产物抗氧化能力大小。

1.2.6 统计分析

实验数据以x±SD表示(n=3)，用Duncan进行差异显著性检验(P<0.05)，Origin 8.0软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 LC-MS/MS测定橄榄苦苷及其水解产物

LC-MS/MS测定油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷及其水解产物(橄榄苦苷元、烙醇苷元、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇)的总离子流图如图2所示，其线性范围、回归方程和相关系数参数如表2所示。初始提取物(即未加水解酶)中各目标物含量如表2所示。由此可见，各成分在所述线性范围内线性关系良好(R2≥0.999)，本方法简单、快速、灵敏，适用于橄榄苦苷及其水解产物的定性和定量分析。

注：1～6分别表示橄榄苦苷、橄榄苦苷元Oleuropein aglycon、烙醇苷元Ligstroside aglycon、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇。
图2 LC-MS/MS测定油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷及其水解产物的总离子流色谱图

表2 定量分析橄榄苦苷及其水解产物的的线性范围、回归方程和相关系数参数

2.2 酶种类的筛选

分别采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶(来自A. niger)、β-葡萄糖苷酶(来自杏仁)、半纤维素酶(A. niger)、纤维素酶7种酶进行酶解实验，分析了不同酶对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷水解程度的影响，结果如图3所示。7种酶对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷的水解效果顺序为：β-葡萄糖苷酶(A. niger)>β-葡萄糖苷酶(来自杏仁)>半纤维素酶(A. niger)>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>纤维素酶>碱性蛋白酶。本研究发现，各种水解酶在醇提过程中可以不同程度提高橄榄苦苷的水解率，其原理在于各种水解酶作用于原料分子中，促进原料中的橄榄苦苷的释放；其中以β-葡萄糖苷酶的酶促水解效果最佳。木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等蛋白酶均主要作用于蛋白质或肽，文献报道这些蛋白酶能使植物细胞壁和细胞膜结构被破坏，释放活性成分[15,19]，而本研究发现这种效果较弱。

图3 非酶处理与不同种酶处理对橄榄苦苷水解率的影响

2.3 β-葡萄糖苷酶(A.niger)处理对橄榄苦苷水解产物的影响

重点分析了β-葡萄糖苷酶(A.niger)处理对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷水解产物的影响，如图4所示。随着水解时间的延长，油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷的含量持续下降，其中0～4 h时间段橄榄苦苷含量迅速下降，该时间段油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷元浓度迅速上升，4 h后趋于平衡；而随着油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷的含量迅速下降(0～4 h时间段)，水解产物烙醇苷元、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元和羟基酪醇等浓度显示出不同程度的增加(如图4所示)。油橄榄叶提取物经过酶法辅助提取和水解处理后，其橄榄苦苷元、烙醇苷元、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇含量分别为：5.35、0.12、0.28、0.02、0.76 μg/mL；与初始提取物(即未加水解酶)中目标物含量相比(如表2所示)，酶法辅助提取和水解处理可以显著提高产品中功效成分的含量。油橄榄叶提取物酶解工艺与传统的酸解、碱解工艺相比，酶解方法条件较温和，整个过程减少了酸、碱催化剂的使用，是一种可以进一步开发利用的水解方式[22-23]。

图4 β-葡萄糖苷酶(A. niger)处理对橄榄苦苷水解产物的影响

2.4油橄榄叶提取物水解前后的抗氧化能力比较分析

评价提取物及其水解产物体外抗氧化能力，常选择自由基清除率达到50%时测试对象的浓度作为评价指标，即半数抑制浓度IC50。IC50值越小，表示抗氧化剂清除自由基的能力越强，反之，IC50值越大，表示抗氧化剂清除自由基的能力越弱。

采用三价铁离子还原法、DPPH·体系对油橄榄叶提取物(即未加水解酶)及其水解产物(即添加β-葡萄糖苷酶(A. niger)后的稳定水解产物)抗氧化活性进行研究，以VC、BHT、橄榄苦苷、羟基酪醇为对照。如图5所示，在FRAP法中，羟基酪醇还原Fe～(3+)的能力最强(IC50=4.3 μg/mL)，还原Fe～(3+)的能力顺序为：羟基酪醇>油橄榄叶提取物水解液(A. niger)>橄榄苦苷>VC>BHT>油橄榄叶提取物(未加水解酶)；其中油橄榄叶提取物水解液(A. niger)还原Fe～(3+)的能力与羟基酪醇较为接近。油橄榄叶提取物水解液(A. niger)的还原能力要大于VC(2.12倍)和BHT(5.95倍)，油橄榄叶提取物水解液(A. niger)的清除DPPH·的能力要大于VC(1.29倍)和BHT(3.38倍)。此外，当油橄榄叶提取物及其水解产物和对照品对DPPH·的清除率达到50%，羟基酪醇浓度最小，油橄榄叶提取物水解液(A. niger)的浓度次之，油橄榄叶提取物水解液(A. niger)的浓度最大。油橄榄提取物[即添加β-葡萄糖苷酶(A. niger)]的抗氧化能力弱于羟基酪醇而强于橄榄苦苷，其可能原因在于所提取的提取液中均含有该两种成分及其水解产品，各成分之间存在协同抗氧化作用。