气肿疽梭菌多克隆抗体的制备及Dot-ELISA检测方法的建立

张 皓， 姜永越， 陈 竞， 于建华， 金 鑫*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133000； 2.图们市农业和畜牧业局,吉林 图们 133100)

气肿疽梭菌是主要引起反刍动物急性、热性传染病的病原体。该菌是专性厌氧菌，但极易形成芽孢，广泛存在自然界中。世界很多国家均有该病的爆发[1]。我国很多地区也在流行着气肿疽，对我国以及世界畜牧业的危害十分严重，而且气肿疽的感染范围在不断扩大。感染动物不仅限于反刍动物，猪感染气肿疽也时有发生，近年还有人感染气肿疽的报道[2-4]。可见，气肿疽的影响不仅仅是畜牧业，还严重危及着人类的健康[5]，因此，对气肿疽的快速诊断与检测研究具有重要意义。

目前对气肿疽的检测尚无标准方法，传统的AGID试验存在特异性低、灵敏度弱等缺陷。近年气肿疽血清学检测方法在ELISA检测方法中已有突破，车达等[6]人采用气肿疽梭菌菌体裂解抗原为包被抗原建立的间接ELISA诊断方法，其特异性及灵敏度都达到很高水平，该方法有望在试剂盒的生产中得到普及应用，但其检测结果还需在酶标仪等设备下进行，因此不适于基层现场的应用[7-9]。

本试验探索了Dot-ELISA用于检测气肿疽梭菌病原的可行性，并就影响抗原抗体检测的因素进行了讨论和条件优化，旨在为气肿疽梭菌的临床诊断提供更为简便、快速、特异、敏感的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

气肿疽梭菌标准株C54-1,购自中国兽医药品监察所；试验动物SPF豚鼠，购自长春亿斯试验动物中心；标准阳性血清和阴性血清采自试验豚鼠；全菌抗原和分泌抗原从致病豚鼠脏器分离培养后提取,由延边大学农学院预防兽医实验室保存。

1.2 主要试剂

标准蛋白Marker(购自华美科技有限公司)；HRP羊抗豚鼠IgG和BSA，购自美国西格玛公司；DAB(购自中杉金桥生物技术有限公司)；PVDF膜(购自拜尔迪生物技术有限公司)；滤菌膜(0.22、0.45 μm)(购自美国PALL公司)；其他试剂为国产分析纯。

1.3 阳性血清的制备

将培养的气肿疽梭菌培养液离心获得菌体菌液，在冰水浴下超声波破碎裂解出菌体抗原；将粗提的菌体抗原经SephadexG-200过滤，以每管1 mL收集抗原蛋白。将纯化的菌体抗原接种10只豚鼠，第1次0.1 mg，第2次0.2 mg，第3次0.3 mg，每次间隔7 d。最后1次接种5 d后心脏采血分离血清。

1.4 Dot-ELISA操作程序

将抗体用0.01 M pH值为7.4的PBS(含1%BSA)稀释100倍，用微量进样器吸取1 μL高免血清点到经过压迹后的pvdf膜片正面方格正中央，置于37 ℃恒温箱干燥或者自然晾干。将干好的膜片取出放进封闭液中浸泡30 min，保存于4 ℃冰箱中备用。膜片剪成4 mm2的方格，正面朝上加入孔中。每孔加入50 μL,用0.01 mol/L pH值为7.4的PBS稀释成1∶80倍的抗原，每块反应孔均设置阴性对照，整体设置空白孔作对照和阳性对照，放入37 ℃恒温箱作用30 min。每孔加入50 μL含0.1% BSA的0.01 mol/L pH值为7.4的PBS稀释成1∶2 000倍的酶标二抗，放于37 ℃反应30 min。每孔加入50 μL现配的DAB溶液,置于37 ℃恒温箱中作用15 min。加入蒸溜水终止反应，晾干。

结果以下述标准判定：强阳性呈深棕色斑点，斑点与周围接线清晰、明了；弱阳性呈浅棕色斑点，斑点周围界限清晰或斑点内有不均质浅棕色斑点；阴性没有斑点。每次试验均设立阳性、阴性血清对照，空白膜片对照，血清空白对照和酶空白对照，对照成立才能做出判定。

1.5 最佳工作条件的筛选

1) 血清最适稀释倍数的确定 将血清由1∶2倍比稀释至1∶10 240，分别与相同浓度的抗原作用，保持酶标二抗浓度及孵育条件一致，根据判定标准筛选出最适血清稀释倍数。

2) 抗原最适浓度的确定 抗原调节浓度为1 mg/mL,将提取的被检抗原由1∶2倍比稀释至1∶40 960，菌体抗原于PVDF膜上点样，分泌抗原于NC膜上点样，采用 Dot-ELISA 方法进行试验，依据判定标准筛选最佳抗原浓度，作为试验抗原最适工作浓度。

3) 酶标二抗最适稀释倍数的确定 将HRP标记羊抗豚鼠IgG从1∶125倍比稀释至1∶64 000，其他条件不变，筛选最佳二抗浓度。

4) 封闭液及封闭时间最适的确定 5%脱脂乳、1%BSA、3%豚鼠血清、3%兔血清，以0.01 mol/L pH值为7.4的PBS为空白对照，封闭时间分设置为20、30、40、50、60 min，进行间接 Dot-ELISA。

5) 底物最适反应时间的确定 其他条件最适情况下，DAB显色液分别显色5、10、15、20、25、30、35、40 min，进行试验。

6) 最适反应温度及时间的确定 控制抗原抗体浓度最适的条件，将反应分别放置于4 ℃、室温和37 ℃恒温条件下作用，同一温度下分别作用20、30、40、50 min，观察显色斑点颜色。

1.6 Dot-ELISA敏感性试验

将纯化的抗原用0.01 mol/L pH值为7.4的PBS以10倍比连续稀释，按已经建立的双抗体夹心Dot-ELISA方法进行检测，重复3次，并设置阴性和空白对照。

1.7 Dot-ELISA特异性的检测

1) 交叉反应试验 以最适浓度的抗血清包被的PVDF膜，分别与腐败梭菌抗原、产期荚膜梭菌B、C、D、E型抗原及气肿疽梭菌抗原，建立的双抗体夹心法Dot-ELISA进行多次重复检测。

2) 阻断试验 将抗原做1∶10～1∶10 240 倍稀释，同一稀释度分成2组，一组加等量诊断血清，另一组抗原加等量血清稀释液作为对照，并用双抗体夹心 Dot-ELISA 方法检测，最后以加血清的阻断组不显示斑点，不加抗原的未阻断组显现明显斑点，判定为特异性反应。

1.8 比较试验

以分离延边气肿疽梭菌强毒株菌体直接肌肉注射20只豚鼠，建立气肿疽梭菌感染模型，对死亡豚鼠剖检，无菌采集其肝、脾、心、肺、肾、肌肉，制成菌悬液，用AGID法和建立的双抗体夹心Dot-ELISA方法同时检测以上豚鼠抗原样本，对比阳性检出率。

1.9 临床样本的检测

利用所建立的双抗体夹心Dot-ELISA方法和云巾宴所建立的PCR方法[10],对50份病料进行检测。取病料组织小块分别在无菌条件下研磨，制成菌悬液，同时应用2种方法检测，并对比检测结果。

2 结果与分析

2.1 Dot-ELISA 试验条件的筛选

2.1.1 血清最适稀释倍数的确定

制备的血清与被检抗原反应的最佳工作范围是 1∶2～1∶2 048，当抗体浓度在以上范围时，可表现明显斑点现象，由于 1∶2 048处于临界状态，强阳性与弱阳性差异不明显，所以选择 1∶1 024 稀释度为最佳稀释倍数操作(图1)。

图1 不同血清稀释倍数的反应结果

2.1.2 被检抗原最适浓度的确定

菌体抗原在1∶512 ，含量为3.125 μg时出现边缘整齐，着色明显与1∶1 024 倍稀释时颜色明显有差异性，分泌抗原在1∶256滴度，含量1.89 μg时差异明显，所以菌体抗原和分泌抗原最适稀释倍数分别选定为1∶512，和1∶256(图2)。

图2 不同被检抗原稀释倍数的反应结果

2.1.3 酶标二抗最适稀释倍数的确定

将HRP标记的羊抗豚鼠IgG由1∶125倍比稀释至1∶64 000 。以最佳血清包被浓度和最佳抗原稀释度进行Dot-ELISA检测，当酶标二抗稀释由1∶125倍比稀释至1∶4 000时,反应膜片的颜色明显，故本试验选取1∶4 000作为最适酶标二抗稀释浓度(图3)。

图3 酶标二抗最适稀释度确定

2.1.4 最适封闭液及封闭时间的确定

结果显示37 ℃ 1%BSA封闭30 min效果最好，背景色差异最大，斑点清晰。

2.1.5 最适反应时间及温度的确定

在抗原及抗体浓度最适的条件下，室温条件和37 ℃条件下诊断膜片上的斑点印迹明显，反应作用 30 min以上时诊断膜上斑点的颜色便不随时间的增加而加深，为试验的精确性起见，以37 ℃为试验的标准温度，以30 min作为最适反应时间。

2.2 敏感性测定

在各反应条件确定的前提下，重复3次试验，结果均一致，菌体抗原效价3.125 μg/mL，分泌抗原1.89 μg/mL，阴性对照组无斑点显现。该结果表明,建立的双抗体夹心Dot-ELISA方法具有良好的敏感性(图4)。

图4 敏感性测定

2.3 特异性试验

2.3.1 交叉反应试验

在最佳条件下，重复3次试验，只有气肿疽梭菌阳性血清的膜片出现反应，说明所建立的Dot-ELISA方法有较高的特异性(图5)。

2.3.2 阻断试验

阻断前的强阳性血清、弱阳性血清终点效价分别为1∶5 120和1∶320,而阻断后其各自的终点效价分别为1∶80和1∶20,说明被阻断的是特异性抗体。

图5 Dot-ELISA交叉反应试验结果

2.4 比较试验

应用Dot-ELISA方法检测20只气肿疽病死豚鼠各脏器病原体的阳性率，其中肝脏、脾脏、心脏、肺脏、肾脏、肌肉阳性率分别为95%、95%、90%、 90%、85%和90%，AGID法检测肝脏、脾脏、心脏、肺脏、肾脏、肌肉阳性率分别为29%、31%、25%、 36%、20%和25%(表1)。

表1 Dot-ELISA方法与AGID试验方法比较

2.5 临床样本的检测

利用所建立的双抗体夹心Dot-ELISA方法和PCR方法对50份病料进行检测的结果显示，Dot-ELISA检测出7份阳性样品(检出率为14%)，PCR方法检测出9份阳性样品(检出率为18%)(表2)。

表2 临床样本检测结果

3 讨论与结论

Dot-ELISA检测血清中的抗体时，对采集样本及样本保存运输过程要求高，一旦保存环节出现问题，会对结果判定造成影响。该试验采用了包被抗体检测抗原的方式，方便了样本的收集，只需无菌采集样本即可，使用包被好的快诊膜最快2 h便可以观察到结果，使检测更为方便。双抗体夹心Dot-ELISA检测抗原特异性特别强[11-13],该试验采用了SPF豚鼠，并以纯化的菌体抗原免疫动物，获得的血清得到很好的使用效果。今后对于该技术的研究还可用通过制备单克隆抗体提高检测的特异性和准确性[14-17]。

影响Dot-ELISA结果的因素很多，从样品的采集、保存、加样到洗涤和显色过程中都可产生试验误差，因此，对于Dot-ELISA的操作环节要严格标准，才能提高试验质量[18]。利用96孔板分装载体膜的显色工作要远比ELISA方法复杂，尤其对于几十到上百的样品检测过程中，加入试剂及混匀的时间存在很大差异，使得酶促反应的时间不一致造成试验假阳性或假阴性的结果。对此，可以将样品分批操作，保证同一批样品几乎在同一时间内完成反应，既减少单次试验的时间，也避免了批次内操作的误差[19-20]。

本方法经特异性试验、敏感性试验及比较试验和临床样本检测，该检测方法敏感、特异，可应用于临床快速检测。