产生化黄腐酸菌株的筛选鉴定及应用效果

张林利，王国文，刘 晔，姜 瑛，汪 强

(河南农业大学 资源与环境学院，河南 郑州 450002)

化肥是粮食增产的基础，我国是人口众多的农业大国[1]，农业生产与化肥密切相关。近年来，我国化肥的使用呈现出明显的总消费量大、利用率低的特点[2-3]，造成土壤污染、水污染、大气污染等一系列的环境问题[4]，故发展绿色环保的新型肥料愈来愈被人们所重视。

生化黄腐酸(Biochemical fulvic acid，BFA)是指含有-COOH、-OH和 CH3O- 等活性基团的各类小分子物质、氨基酸、多元有机酸和维生素等组成成分十分复杂的腐植酸类[5]。BFA具有分子量低、易于吸收利用、生理活性较高、水溶性高、絮凝极限高、pH值接近中性、与微量元素有良好的相溶性等特点[6-7]，可以作为一种新型微生物菌肥，解决我国化肥使用所带来的环境问题。BFA可由农作物秸秆发酵制得。我国农作物秸秆资源丰富，农作物秸秆的不合理处置如焚烧、闲置等，不仅仅使农作物秸秆等生物质资源大量浪费，还引起严峻的环境污染等一系列问题[8]。玉米是我国第一大粮食作物，玉米秸秆产出量约占我国农作物秸秆总产出量的近1/3[9-10]。以玉米秸秆为原料发酵制取BFA，既是对农业秸秆等生物质资源的有效利用，又为新型微生物菌肥的制备奠定了基础，在维护地球生态、提高农作物品质和产量，促进农业生产的可持续发展等方面具有十分重要的意义[11-13]。

近些年，国内外相关学者对BFA在应用方面的研究较多[14-18]，但利用农作物秸秆发酵生产BFA及BFA发酵菌株选育方面的研究几乎未有涉及。为此，从砂质潮土中筛选出能够发酵生产BFA且效果较好的菌株，并以玉米秸秆为原料进行所筛选菌株的发酵试验，发酵结束后将其固体发酵产物施于大田中，与市场已有的BFA肥料相比较，以验证发酵产物的效果，旨在为我国农作物秸秆等生物质资源的高效利用、新型生物肥料的研制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.2 培养基 LB培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、琼脂20 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 值7.0～7.2，1×105Pa灭菌20 min。

扩大培养基：不加琼脂，其他同LB培养基。

发酵培养基:发酵原料为玉米秸秆，pH值自然[19]。

1.1.3 黄腐酸(FA)肥料及作物 FA肥料由Shanghai EKEAR Bio@Tech Co.LTD提供。供试作物为玉米。

1.2 产BFA菌株的筛选、鉴定

在实验室内，将所取土样制成土壤菌悬液，并按10倍梯度稀释法将悬浮液稀释至10-6，将不同浓度的悬浮液涂布在 LB平板上，30 ℃倒置培养24 h，分离纯化出不同菌株[20]。然后将所筛菌株用扩大培养基在摇床上180 r/min、30 ℃培养1 d。将菌液与灭菌骨粉以1∶1的比例混合后发酵，之后晾晒1～3 d，制成固体菌剂，以2%的接种量接种于发酵培养基中发酵，设置不添加菌剂的发酵培养基为对照(CK)，最后以产物中的FA(腐植酸的重要组分之一)含量作为判定指标，以判定该菌株能否发酵生产 BFA。然后通过形态、生理生化指标以及16S rDNA序列比对分析对菌株进行综合鉴定[21-25]。

1.3 产BFA菌株的应用效果

试验以玉米秸秆(含水率控制在50%左右)为发酵原料，固体菌剂接种量为2%，尿素(氮源)添加量为2%，发酵时间为25 d，堆置于发酵池的上层进行发酵。发酵产物应用效果试验共设7个处理，即 T1(不施加任何发酵产物)、T2(施加 YC8发酵产物)、T3( 施加 YM3发酵产物)、T4(施加 HS3发酵产物)、T5(施加 HS4发酵产物)、T6(施加 YC4发酵产物)、T7(施加市售商品FA肥料)，小区面积为4×4=16 m2，随机区组排列，每个处理3个重复。

肥料施用方法：氮肥选用尿素，磷肥选用过磷酸钙(含P2O512%)，钾肥选用硫酸钾(含K2O 50%)，施用量分别为210、120、75 kg/hm2。氮肥1/2在苗期沟施，1/2在大喇叭口期穴施，磷、钾肥在苗期一次性沟施，各发酵产物和商品BFA肥料与氮肥同时施用(每次100 kg/hm2)。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 FA含量 用重铬酸钾容量法测定[26]

在充分发挥机械化作用下挖运土石料，既要确保合理布置工作面，还要使车厢与铲斗具有合理的容量比值，可按照表1参数值制定具体挖运方案。

1.4.2 土壤养分含量 土壤速效磷含量采用Olsen法测定；土壤速效钾含量采用中性CH3COONH4浸提—火焰光度法测定。

1.4.3 植株养分含量 玉米植株全氮含量采用AA3流动注射分析仪测定；玉米植株全磷含量采用钼蓝比色法测定[27]。

1.5 数据处理

分别采用SPSS 20.0、Excel 2010和OriginPro 8.5进行方差分析和制图,用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 产BFA菌株的筛选、鉴定

从所采集土壤中共分离纯化出菌株18株，然后将分离纯化的18株菌分别制成固体菌剂，以2%的接种量分别接种于发酵培养基中进行发酵，以产物中FA含量作为判定指标，最终得到7株发酵效果较好的菌株，分别命名为YC8、YM3、HS3、HS10、YM4、HS4和YC4。由定量数据可知(图1)，HS4菌株的产 BFA能力最强，FA含量可达到20.91%，比CK增加287.94%，显著高于其他菌株的发酵结果。YM3菌株的发酵产物中FA含量达13.65%，比CK (5.39%)增加153.25%。以筛选出的YC8、YM3、HS3、HS4、YC4 五株产BFA效果较好的菌株进行大田应用效果研究。

不同小写字母表示不同处理之间的差异显著(P<0.05)图1 不同菌株发酵产物中FA含量的比较

对上述效果较好的5株菌株通过形态、生理生化指标以及16S rDNA序列进行鉴定，结果发现，YC8、YM3、HS3、HS4、YC4分别为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酸快生芽孢杆菌(Bacillusacidiceler)、壁芽孢杆菌(Bacillusmuralis)、弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)[21-25]，将其序列号在 NCBI上比对上传获得登录号分别为KP743128、KP743130、KP743120、KP743121、KP743125。

2.2 产BFA菌株的应用效果

2.2.1 产BFA菌株发酵产物对土壤速效养分含量的影响 由图2可知，在玉米五叶期，7个处理的土壤速效磷含量之间的差异不显著，T3、T4、T5、T6处理高于T1处理，且T3、T5、T6处理相对较高；在大喇叭口期，T2—T7处理土壤速效磷含量均较T1处理增加，其中T3、T7处理差异显著，以T7处理最高，随后依次为T3、T6处理，T3、T4、T5、T6、T7处理之间的差异不显著，T3处理显著高于T2处理；在成熟期，T2—T7处理土壤速效磷含量均较T1处理增加，其中T3、T5、T6、T7处理差异显著，分别比T1处理提高了32.45%、20.44%、15.32%、24.35%，以T3处理最高，随后依次为T7、T5处理，T3处理较T7处理提高6.51%。

由图2可知，在玉米五叶期，T2—T7处理土壤速效钾含量均较T1处理增加，其中T2、T3、T7处理差异显著，分别比T1处理提高28.35%、34.57%、42.62%，T7处理显著高于T2处理，T3处理与T2、T7处理之间的差异均未达到显著水平；大喇叭口期，7个处理的土壤速效钾含量之间的差异不显著，T2—T7处理均较T1处理有所增加，以T5处理最高，较T1处理增加了1.94%，随后依次为T4、T2处理；在成熟期，T2—T7处理土壤速效钾含量均较T1处理增加，其中T2、T6处理差异显著，分别较T1处理提高了17.47%、20.37%，T2处理较T7处理提高7.40%。

综上，T3处理对增加土壤速效磷含量作用明显，T2处理对增加土壤速效钾含量作用明显。

同一时期不同小写字母表示不同处理之间的差异显著(P<0.05)图2 产BFA菌株发酵产物对土壤速效养分含量的影响

2.2.2 产BFA菌株发酵产物对玉米产量及其构成因素的影响 由表1可知，与 T1处理相比，T2—T7处理的玉米穗粒数和千粒质量均略有增加，但差异不显著，穗粒数以T6处理最高，较 T1处理提高了9.12%；千粒质量以T7处理最高，随后依次为T3、T5处理。与T1处理相比，T2—T7处理的玉米产量均显著增加，T7处理最高，然后依次为T4、T6处理，分别较T1处理增加14.19%、13.39%、11.79%；除T5处理显著低于T7处理外，其余处理均与T7处理差异不显著。

表1 产BFA菌株发酵产物对玉米产量及其 构成因素的影响

注：同列数据后不同小写字母表示不同处理之间的差异显著(P<0.05)，下同。

2.2.3 产BFA菌株发酵产物对玉米植株地上部干质量和氮、磷积累量的影响 不同处理对玉米植株地上部干质量和氮、磷积累量的影响如表2所示，在所有时期，均表现为T2—T7处理玉米植株地上部干质量和氮、磷积累量高于T1处理。

在五叶期，对植株地上部干质量来说，T3、T6处理效果较好，分别比T1处理显著增加57.15%、49.05%，且与T7处理之间的差异不显著；对地上部氮素积累量来说，T2、T4处理效果较好，且效果优于T7处理；对地上部磷素积累量来说，T5处理效果最好，与T1处理之间的差异达到显著水平，与T7处理之间的差异不显著。

在大喇叭口期，对植株地上部干质量来说，T2、T3、T4、T6处理效果较好，分别较T1处理显著增加14.77%、13.64%、26.79%、23.27%，同时显著低于T7处理；对地上部氮素积累量来说，T3、T5、T6处理效果较好，均与T7处理之间的差异不显著，同时显著高于T1处理；对地上部磷素积累量来说，T2、T4处理效果较好，分别较T1处理显著增加22.82%、24.47%，且与T7处理之间的差异不显著。

在成熟期，对植株地上部干质量来说，T2处理效果最好，较T1处理显著增加38.57%，与T7处理之间的差异不显著；对地上部氮素积累量来说，T3、T5处理效果较好，分别较T1处理显著增加8.71%、13.30%，与T7处理之间的差异不显著；对地上部磷素积累量来说，T5处理效果最好，较T1处理显著增加16.04%，与T7处理之间的差异不显著。

总体上，T2、T3、T4、T6处理对增加植株地上部干质量的作用明显，T2、T3、T5处理对增加植株地上部氮素积累量的作用明显，T2、T4、T5处理对增加植株地上部磷素积累量的作用明显。

表2 不同处理对玉米植株地上部干质量及氮素、磷素积累量的影响 kg/hm2

3 结论与讨论

BFA在农作物方面的应用具有多个优点，袁瑞江等[28]研究表明，BFA能够促进植物生长发育，增强植物抗逆性，改善产品品质等。BFA可由农作物秸秆利用微生物发酵制得，王连棋等[29]研究表明，微生物在秸秆发酵腐解过程中不断进行分解代谢和合成代谢，有机物可被分解成无机态的氮、磷、钾等较小的分子物质，而小分子营养物质有利于植物的生长。

土壤速效养分指植物根系可直接吸收加以利用的养分形态，是农作物获得高产的保证。本研究结果表明，施加YM3发酵产物处理对增加土壤速效磷含量效果明显，施加YC8发酵产物处理对增加土壤速效钾含量效果明显，这与司小明[30]的研究结果类似。施加 HS3发酵产物处理对增加玉米产量效果最好，随后依次为施加YC4、YM3发酵产物处理，这与鲁宇菡等[31]的研究结果相似。

植株中的氮、磷含量反映玉米植株的营养状况。本试验中总体上施加 HS3发酵产物处理对玉米植株地上部干质量的增加效果最好，施加YM3发酵产物处理使植株地上部氮素积累量较对照显著增加，施加HS4发酵产物处理使植株地上部磷素积累量较对照显著增加，这与沈讷敏[32]研究结果类似。

综上，本试验中共筛选出发酵玉米秸秆生产BFA效果较好的5株菌株，分别命名为YC8、YM3、HS3、HS4、YC4。经形态、生理生化指标以及16S rDNA鉴定结果发现，这5株菌分别为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酸快生芽孢杆菌(Bacillusacidiceler)、壁芽孢杆菌(Bacillusmuralis)、弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)。大田试验结果表明，所筛选出的5株菌均能不同程度地增加土壤速效养分、玉米产量、地上部养分含量等，且大部分与市售商品黄腐酸肥料的应用效果无显著差异，甚至个别菌株优于市售商品黄腐酸肥料的应用效果。该结果在发酵玉米秸秆生产BFA新型生物肥料方面有较大的应用潜力。