miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

边艳杰，韩金汾，段江燕

(山西师范大学 生物化学教研室，山西 临汾 041004)

MicroRNA(miRNA)是一类单链非编码RNA分子，成熟的miRNA含有19～25个核苷酸，是由具有茎环结构的miRNA前体加工而成。在动物体内，miRNA调控基因的表达主要通过与其靶mRNA 3′UTR序列互补结合抑制其翻译或特异性切割靶mRNA使其降解来实现。 作为体内重要的转录后调控因子，miRNA几乎在所有的生物学过程中都发挥着重要作用，如发育、细胞增殖、凋亡和分化[1]。miR-200家族主要由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429和miR-141组成，根据它们在染色体上位置的不同，miR-200的家族成员分为miR-200b/a/429簇与miR-200c/141簇。

乳腺是哺乳动物体内唯一反复进行多次发育与退化的重要器官，乳腺的发育与泌乳除受到细胞因子、激素等调控外，miRNA的异常表达也会对泌乳功能造成重要的影响[2-5]。虽然目前关于miRNA在乳腺中的研究已有一些报道，但是对一些泌乳调控中重要功能性miRNA的挖掘仍然非常有限。Wang等[6]研究发现，miR-152能介导甲基转移酶DNMT1的表达促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖及泌乳。Bian等[7]报道显示，miR-29s参与调控乳腺泌乳主要通过靶控甲基转移酶DNMT3a及DNMT3b的表达。金晶等[8]通过small RNA测序发现，miR-200b在不同乳品质的奶牛乳腺中的表达量差异显著，推测其可能参与奶牛乳腺乳成分合成的调控。张犁苹等[9]研究发现，与干奶期乳腺组织相比，奶山羊泌乳中期miR-200家族的表达量显著增加，推测其在乳蛋白、乳脂的合成中也具有重要的调控作用。目前，关于miR-200家族成员的生物学功能研究报道，主要集中在肿瘤进程调节方面[10-11]，而在乳腺泌乳调控中的研究还不曾报道。鉴于此，以奶牛乳腺上皮细胞系作为体外细胞模型，通过细胞中过表达miR-200b，探讨其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响，以期为我国奶业乳品质量的优化提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所用的中国荷斯坦奶牛均为泌乳期奶牛，选自黑龙江畜牧业科技园区，具有相近的遗传背景、胎次和产奶量。依据产乳品质的不同将6头试验奶牛划分成高乳品质H组和低乳品质L组(每试验组3头)。高乳品质H组：平均乳蛋白率(3.27±0.04)%、乳糖含量(4.84±0.03)%、平均乳脂率(4.17±0.01)%；低乳品质L组：平均乳蛋白率(2.89±0.02)%、乳糖含量(4.52±0.09)%、平均乳脂率(3.20±0.06)%。取乳腺深层组织，每块组织体积均匀，约为1 cm3，用生理盐水(含0.01% DEPC，已灭菌)进行清洗，后用于细胞培养。

Trizol、MMLV逆转录酶购自Invitrogen公司，Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit(miR-200b、内参5S rRNA)及siRNA-Mate转染试剂购自上海吉玛生物技术公司，miR-200b mimics及阴性对照Scr购自韩国Bioneer公司，DMEM/F12以及胎牛血清购自Gibco公司，Lactose/D-Galactose(Rapid) Assay Kit购自Megazyme公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自TaKaRa公司，甘油三酯定量检测试剂盒购自普利莱基因技术公司，β-酪蛋白(CSN2)检测试剂盒购自Uscn Life Science公司，细胞培养皿购自康宁公司，Cell-LightTMEdU Apollo1567 In Vitro Imaging Kit购自广州RiBoBio公司，NaCl等其他常用试剂为国产分析纯级。

1.2 TaqMan qRT-PCR检测miR-200b在不同产乳品质奶牛乳腺组织中的表达

添加液氮，将乳腺组织研成粉末，收集至RNase-Free EP管中，加入1 mL Trizol，剧烈振荡，室温孵育10 min，然后加入0.2 mL氯仿，混匀15 s后静置孵育3 min，于4 ℃、12 000 r/min转速离心15 min，吸取上层水相至新EP管中，加0.5 mL异丙醇(-20 ℃预冷)，轻轻混匀后，静置孵育10 min，12 000 r/min离心10 min，收取沉淀，并用75%乙醇洗涤，7 500 r/min离心15 min后，倒掉75%的乙醇，用滤纸蘸去多余水分，风干沉淀，用RNase-Free水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳检测获取的RNA质量。将提取的完整的总RNA进行逆转录及PCR检测，具体操作参照MMLV逆转录酶及Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit操作说明书，PCR反应结束后，采用2-ΔΔCt方法计算miR-200b在各组样品中的相对表达量[12]。

1.3 miR-200b mimics转染奶牛乳腺上皮细胞

本试验中奶牛乳腺上皮细胞的原代培养采用组织块法，胰酶消化法进行后期上皮细胞的纯化，将纯化后的乳腺上皮细胞接种至细胞培养瓶中，培养液为含10%血清的DMEM/F12，细胞于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。取浓度约为5×104个/mL的细胞悬液进行接种，待培养板中细胞密度为80%时，进行转染操作。取DMEM/F12细胞培养基(不含双抗及血清)95 μL，滴加siRNA-Mate转染试剂5 μL，轻轻混匀，室温孵育5 min，加入miR-200b mimics及阴性对照Scr，其终浓度为100 nmol/L，混匀后静置10 min。空白对照组(Mock)只滴加siRNA-Mate试剂。转染6 h后，荧光显微镜分析细胞转染效率，若转染效率满足试验要求，用含10%血清的DMEM/F12继续培养细胞。转染48 h后，收集细胞样品，Trizol法提取总RNA，qRT-PCR检测miR-200b的表达。

1.4 miR-200b靶基因的生物信息学预测

通过生物信息学软件，对miR-200b可能的靶基因进行在线预测，根据TargetScan(http://www. targetscan.org/)及miRanda (http://www.microrna.org/)网站提供的miR-200b靶基因预测相关数据，筛选出与奶牛乳腺发育及泌乳相关的重要功能调控基因。通过分析TargetScan 7.2得到的数据，明确miR-200b与其靶基因可能结合的调控位点。

1.5 miR-200b过表达对预测靶基因及泌乳相关功能基因mRNA表达的影响

转染阴性对照Scr及miR-200b mimics 48 h后，Trizol法提取总RNA，qRT-PCR检测miR-200b过表达组及对照组中预测的miR-200b靶基因的表达量，同时检测对乳成分合成功能基因Akt、Csn2、Srebp1、Glut1 mRNA表达的影响，具体操作步骤参照文献[7]。β-actin为内参基因，结果用2-ΔΔCt法进行计算。试验中所涉及引物由华大基因公司合成，相关序列见表1。

1.6 miR-200b过表达对奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖的影响

转染阴性对照Scr及miR-200b mimics 96 h后，应用CASY细胞分析仪(Schärfe System，德国)检测miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞活力的影响。胰酶消化细胞成单细胞悬液，吸取待测细胞样品，将其加入10 mL的等电压电解质溶液CASY-TON中，运行分析仪器，将检测结果存为活细胞数据。吸取单细胞悬液200 μL，加入600 μL乙醇，轻轻混匀，静置约6 min，确保细胞完全死亡，加入10 mL的CASY-TON，混匀后运行仪器进行检测，将检测结果存为死细胞数据，并进行活细胞与死细胞图像叠加，将二者交叉处所对应的X轴数值设定为标线位置。吸取100 μL的单细胞悬液加入10 mL的CASY-TON，充分混匀后置于分析仪器外部的电极处，检测各组细胞活力的变化。参照文献[7]，应用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)标记法，检测转染miR-200b mimics 96 h后处于增殖期的奶牛乳腺上皮细胞，激光共聚焦观察细胞，结果用Image Pro-Plus 6.0软件进行图片分析，算出S期细胞百分比，判断细胞的增殖情况。

表1 miR-200b预测靶基因及乳成分合成相关

1.7 miR-200b过表达后奶牛乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖及甘油三酯的测定

miR-200b mimics及阴性对照Scr转染奶牛乳腺上皮细胞 96 h，取细胞培养液，分别于450 nm和550 nm处检测各组培养液中β-酪蛋白和甘油三酯的含量；烘干法对培养液进行浓缩处理，于450 nm处测定培养液中乳糖的含量。

1.8 统计分析

SPSS 13.0进行试验数据的统计分析，试验均重复3次，结果以平均值±标准差表示。采用t检验分析各试验组的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 miR-200b在不同产乳品质奶牛乳腺组织中的表达水平

将5S rRNA cDNA作为内参，进行qRT-PCR数据分析，结果如图1所示，与L组相比，miR-200b在H组中的表达量极显著上调，miR-200b在不同产乳品质奶牛乳腺组织中差异表达，推测其可能与奶牛乳腺泌乳调控相关。

H：高乳品质组； L：低乳品质组 **表示处理间差异极显著(P<0.01)，下同图1 miR-200b在不同产乳品质奶牛乳腺组织中的表达水平

2.2 miR-200b mimics转染率及过表达效果检测

图2A为纯化后的奶牛乳腺上皮细胞，由图可知，奶牛乳腺上皮细胞形态均一，细胞呈现为多边形鹅卵石样。将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的阴性对照Scr，以及通过瞬时转染法转入细胞的miR-200b mimics，使用荧光显微镜观察，记录转染6 h后的转入效率。结果如图2B所示，在奶牛乳腺上皮细胞内可观测到较多的绿色荧光，表明转染效果较好。转染miR-200b mimics 48 h后，过表达组与对照组相比miR-200b表达量极显著升高(图2C)，表明转染 miR-200b mimics能够实现miR-200b的过表达。

A：纯化的奶牛乳腺上皮细胞； B：转染FITC标记的 miR-200b mimics； C：qRT-PCR检测miR-200b过表达效果图2 奶牛乳腺上皮细胞中miR-200b mimics转染效率及miR-200b过表达效果的检测

2.3 miR-200b靶基因的生物信息学预测

结合TargetScan与miRanda 靶基因生物学预测软件的分析结果，通过比较筛选出3个与奶牛乳腺发育与泌乳调控关系密切的功能基因，分别为Pten、Dnmt3a、Dnmt3b，将这3个与奶牛乳腺泌乳相关的功能基因作为miR-200b的预测靶基因进行后续的研究分析。miR-200b与预测靶基因3′UTR 结合情况如表2所示，miR-200b 的7个种子序列分别与PtenmRNA 3′UTR 2515—2521处、Dnmt3bmRNA 3′UTR 1417—1423处、Dnmt3amRNA 3′UTR 694—700处的碱基序列匹配互补。

表2 miR-200b靶基因预测结果

2.4 miR-200b过表达对预测靶基因mRNA表达的影响

转染48 h后，qRT-PCR检测预测的miR-200b靶基因mRNA表达，结果见图3，过表达miR-200b后PtenmRNA的表达量与对照组相比降低了约40%，差异显著，而miR-200b表达量上调对Dnmt3a与Dnmt3bmRNA水平的影响并不显著。

*表示差异显著(P<0.05),下同图3 miR-200b过表达对靶基因mRNA表达的影响

2.5 miR-200b过表达对乳成分合成相关信号通路关键基因mRNA表达的影响

图4结果表明，转染48 h后，奶牛乳腺上皮细胞中乳成分合成相关信号通路关键基因Akt、Srebp1、Csn2的mRNA表达量分别上调了1.9、2.3、3.2倍，与空白对照组(Mock)和阴性对照组(Scr)相比差异极显著。Glut1的mRNA表达量上调1.6倍，差异显著。

图4 miR-200b过表达对乳成分合成相关功能基因mRNA表达的影响

2.6 miR-200b过表达对奶牛乳腺上皮细胞活力与增殖的影响

转染96 h后，CASY分析细胞活力的变化。结果如图5A所示，与对照组相比，miR-200b过表达显著提升了奶牛乳腺上皮细胞的活力。miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响如图5B所示，转染96 h后，DAPI复染细胞核(蓝色荧光)，EdU 标记处于增殖期即S期的细胞(红色荧光)，DAPI染色与EdU标记图片叠加(Merged)后S期的细胞显示为紫色，应用Image pro-plus 6.0计算分析，结果如图5C，miR-200b过表达组奶牛乳腺上皮细胞增殖率显著增加。

2.7 miR-200b过表达对奶牛乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖及甘油三酯的影响

转染96 h后，培养液中分泌的β-酪蛋白含量检测结果如图6A所示，miR-200b过表达组与对照组相比，β-酪蛋白的分泌量极显著提高；甘油三酯含量检测结果如图6B所示，与对照组相比，miR-200b上调后胞外甘油三酯的分泌量极显著升高；乳糖含量检测结果见图6C，与对照组相比，miR-200b的过表达能极显著促进奶牛乳腺上皮细胞乳糖的分泌。

B：EdU技术标记S期细胞图5 miR-200b过表达对奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖的影响

图6 miR-200b过表达对胞外培养液中β-酪蛋白、乳糖及甘油三酯含量的影响

3 结论与讨论

近年来，随着生活质量的不断提高，人们生活水平有了很大改善，对乳品的质量要求也不断增加，如何进一步优化国内奶业乳品质、提升乳品产量已成为了当下奶业科研工作者们面临的重要问题，深入挖掘泌乳生物学调控机制对于乳品质的提升具有重要的指导意义。miRNA作为一类非编码的小分子RNA，同时调控多个靶mRNA，这类小分子RNA与其靶mRNA构成了生物体内复杂的调控网络，影响着疾病的发生、细胞分化、凋亡、增殖、病毒感染以及机体发育等一系列重要的生命活动进程[13-14]，据报道，在人体中约1/3基因的表达受到miRNA调节[15]，miRNA表达发生异常通常会引起细胞调控的改变。大量的研究表明，miRNA在奶牛乳腺发育以及泌乳进程中发挥着重要调节作用[16-20]。金晶等[8]通过small RNA测序技术挖掘了与奶牛乳腺乳成分生成调控相关的miRNA表达谱，发现miR-200b在高乳品质组的表达量显著高于低乳品质组，本研究利用qRT-PCR进行再次验证，结果与small RNA测序数据相符，提示在奶牛乳腺中，miR-200b的生物学功能可能与乳成分的生成以及泌乳量的调控密切相关。

miRNA功能发挥主要通过介导其靶基因的表达来实现，本研究通过生物信息学软件分析，筛选出与奶牛乳腺泌乳密切相关功能基因，分别为Pten、Dnmt3a、Dnmt3b，将这3个功能基因作为miR-200b可能的靶基因进行后续的研究分析。通过在线软件，找到miR-200b与预测靶基因Pten、Dnmt3a、Dnmt3b潜在的结合位点。其中，Pten作为肿瘤中常见的非活性蛋白，主要介导PI3K-AKT信号转导通路的表达，进而参与细胞增殖、凋亡、生长及转移的调节[21-23]。近期有研究认为，PTEN-AKT通路能够诱导催乳素的分泌而参与泌乳调节的启动[24]。Wang等[25]研究也证实在奶牛乳腺上皮细胞泌乳过程中，Pten基因可靶向负调控PI3K-AKT信号转导通路，影响Akt、CyclinD1、S6k1、4Ebp1、Stat5、Csn2、Srebp1、mTOR、Pparγ、Glut1的表达，进而参与细胞的生长与泌乳的调节。DNMT3a与DNMT3b作为DNA甲基化过程中重要的酶类，主要参与生物体的发育调节，已有报道表明，DNMT3a与DNMT3b能够介导乳成分合成相关信号通路基因启动子的甲基化来影响乳腺发育与泌乳[7]。为了验证本研究中生物信息学预测结果，在过表达miR-200b后，检测了细胞中其可能的靶基因Pten、Dnmt3a、Dnmt3bmRNA表达的变化。结果显示，miR-200b上调能够显著抑制PtenmRNA的表达，而对Dnmt3a、Dnmt3bmRNA水平影响不显著。由于条件的限制，未能完成miR-200b对DNMT3a与DNMT3b蛋白水平表达影响的检测，但已有的数据表明，miR-200b能够通过直接调控PtenmRNA的表达参与乳腺泌乳功能调节。

一些泌乳重要功能基因的表达对于乳腺泌乳能力的调节至关重要，Akt是奶牛乳腺泌乳进程中重要的应答因子，它能够被一系列激素或生长因子所激活，在乳腺细胞增殖、乳成分合成、分泌及代谢调控中扮演着重要角色[26]。Akt介导的信号通路在Pten调节的细胞增殖、凋亡与代谢中有着重要的地位，在小鼠乳腺上皮细胞中的研究表明Akt的过表达或者Pten的缺失都能诱导乳腺细胞的迅速分裂[27]。SREBP1作为乳脂合成代谢中一个重要的固醇类调节元件，是脂肪合成相关基因转录的决定子，能够调节乳脂合成关键酶的表达，在脂肪酸的调控和胆固醇的生成中有着至关重要的作用[28]。葡萄糖转运蛋白GLUT1是乳腺上皮细胞中重要的葡萄糖转运载体，它主要介导葡萄糖的转运，参与调节动物乳腺乳糖的合成[29]。奶牛乳腺中β-酪蛋白在具有很强的表达活性，同时它也是牛乳中含量最高的酪蛋白。β-酪蛋白的表达是泌乳能力中乳蛋白合成与分泌的重要衡量指标，在乳腺组织中β-酪蛋白调控能够指导靶基因的高效表达[30]。相关研究显示，这些泌乳功能基因在Pten介导的泌乳调节过程中有着重要的作用[25]，因此，本研究分析了过表达miR-200b后这些乳合成相关信号通路关键基因mRNA的变化。结果显示，miR-200b过表达能显著增加Akt、Srebp1、Csn2、Glut1 mRNA的表达，与Wang等[25]结论相吻合，提示miR-200b可能通过介导其靶基因Pten表达的抑制进而促进泌乳相关信号通路Akt、Srebp1、Csn2、Glut1的表达。

哺乳动物体内，乳腺是能够将体内营养物质转化为食物“奶”的特殊器官，泌乳的发生也是动物进化过程中最重要的结果之一，泌乳进程的完成主要经历乳腺组织的发育、乳汁合成及乳汁分泌等几个生物学阶段。泌乳细胞的活性及数量对乳腺的泌乳能力具有决定性的影响，奶牛乳腺上皮细胞活力及数量的增加能够大大提升乳腺的泌乳能力[31]。过表达miR-200b后，本研究分析了细胞活力的变化，结果表明，miR-200b表达上调后能显著提升奶牛乳腺上皮细胞活力。处于增殖期的细胞即S期细胞中正在复制的DNA分子能够与EdU结合而被标记，该法也是至今监测细胞增殖最准确的方法之一。本研究通过EdU标记分析发现miR-200b过表达能促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖，研究结果与Uhlmann等[32]在乳腺癌细胞的发现相符合，其研究发现在乳腺癌细胞中上调miR-200bc/429簇后，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(p27/Kip1)的表达降低，细胞分裂周期25C基因(CDC25C)表达增加，miR-200b上调能够促进乳腺癌细胞的增殖。在HeLa细胞中，也有报道称miR-200b也能通过直接靶控Rho家族GTP酶3(RND3)上调细胞周期因子cyclin D1(CCND1)的表达，在细胞增殖中具有正调控作用[33]。这些研究表明，miR-200b可以通过靶控几种不同的因子在转录或蛋白质水平上参与细胞生长的调节。本研究结果显示，miR-200b能够负调控靶基因Pten的表达，Pten表达的缺失能够抑制泌乳相关功能基因的表达，进而影响奶牛乳腺上皮细胞的增殖。关于奶牛乳腺中miR-200b的过表达能提高奶牛乳腺上皮细胞活力并促进其增殖的研究也为今后乳腺细胞生物学进程调控研究提供了新的参考。

牛奶是人们日常生活中重要的营养来源，其成分主要包括乳蛋白、乳糖及乳脂。乳腺的泌乳质量也主要体现在乳汁中乳蛋白、乳脂及乳糖的含量上。在牛乳蛋白中，β-酪蛋白作为乳腺上皮细胞分泌的一种磷酸蛋白，占总酪蛋白的48%，因此人们常把β-酪蛋白的含量作为鉴定乳蛋白合成能力的重要指标[34]。在动物体内，脂肪多数以甘油三酯的形式贮存，故甘油三酯的含量也常被用来作为衡量乳腺泌乳能力的重要指标。miR-200b过表达后，奶牛乳腺上皮细胞培养液中分泌的β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的含量均明显增加，提示miR-200b在奶牛乳腺的泌乳生物学调控中具有重要的正调节作用，对我国奶业乳质量改善及乳产量的提升具有重要的理论与生产指导意义。