抗病毒口服液的质量标准改进研究Δ

2018-08-20邱陈劲谢小燕刘潇潇陈佩文杨志业

中国医院用药评价与分析 2018年7期

邱陈劲，孟鹤，谢小燕，刘潇潇，陈佩文，杨志业

(1.广东省药品检验所中药室，广东广州 510180； 2.广州市香雪制药股份有限公司研发部，广东广州 510530)

抗病毒口服液为非处方药，处方包括板蓝根、石膏、知母、连翘、石菖蒲、广藿香、郁金、地黄及芦根等9味药材，具有清热祛湿、凉血解毒之功效，用于风热感冒、温病发热及上呼吸道感染，流行性感冒、腮腺炎病毒感染等疾病，被收载于《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)。市场调查发现，由于连翘叶成本低，有用连翘叶代替连翘的违规投料现象，现行标准无法对其进行控制；板蓝根作为君药，(R，S)-告依春作为抗病毒活性的指标性成分，未对其进行含量测定控制。故本研究增加了(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷的定性指纹图谱及其含量测定，以进一步有效控制抗病毒口服液的质量。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；色谱柱：Waters CORTECS C18柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；Sartorius CP224S型电子天平(德国赛多利斯集团)；KQ-300DA型超声波清洗器(昆山舒美)。

1.2 药品与试剂

供试品：14家企业提供的40批抗病毒口服液样品。对照品：(R，S)-告依春对照品，批号为111753—201304，来源于中国食品药品检定研究院；连翘苷对照品，批号为110821—201514，来源于中国食品药品检定研究院；连翘酯苷A对照品，批号为111810—201405，来源于中国食品药品检定研究院。板蓝根阴性样品、连翘阴性样品为自制。甲醇、乙腈为色谱纯；正丁醇、磷酸为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 检测方法

2.1.1 色谱条件及系统适应性试验：色谱柱为Waters CORTECS C18柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流动相A为0.1%磷酸溶液为，流动相B为甲醇，流动相C为乙腈[1]，梯度洗脱(见表1)；流速1 ml/min；检测波长236 nm[2]；柱温29 ℃。理论塔板数按(R，S)-告依春计算应不低于5 000[3]。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradation elution program

2.1.2 对照品溶液的制备：称取(R，S)-告依春10.54 mg置于20 ml容量瓶，加70%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液Ⅰ[4]。分别称取连翘酯苷A(含量以94.1%计)、连翘苷(含量以93.5%计)对照品15.67、8.82 mg，精密称定，精密量取对照品溶液Ⅰ3 ml置于50 ml容量瓶，加70%甲醇[5]溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷含量分别为0.031 6、0.294 9[6]和0.164 9[7]mg/ml的对照品混合溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备：精密量取抗病毒口服液样品25 ml，用饱和正丁醇振摇提取4次[8]，每次25 ml[9]，合并正丁醇层，60 ℃下减压回收至干[10]，残渣加70%甲醇溶解，转移至25 ml容量瓶中，加70%甲醇至刻度[11]，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 高效液相色谱图：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，见图1。

A.对照品混合溶液；B.供试品溶液；C.板蓝根阴性样品溶液；D.连翘阴性样品溶液A.mixed solution for reference; B.solution for testing product; C.negative sample solution with radix isatidis; D.negative sample with fructus forsythiae图1 高效液相色谱图(液相色谱仪品牌：Agilent)Fig 1 High performance liquid chromatography (brand of liquid chromatograph: Agilent)

2.2 方法学考察

2.2.1 仪器精密度试验：取“2.1.2”项下对照品混合溶液连续6次进样，结果显示，所得峰面积的RSD为0.5%，说明仪器精密度良好。

2.2.2 线性关系考察：称取(R，S)-告依春10.54 mg置于20 ml容量瓶，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液Ⅰ。分别精密称定连翘酯苷A(含量以94.1%计)、连翘苷(含量以93.5%计)对照品10.39、8.22 mg，置于10 ml容量瓶，精密量取“2.1.2”项下对照品溶液Ⅰ2 ml置于上述10 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷含量分别为0.105 4、0.977 7和0.768 6 mg/ml的混合对照品溶液母液。精密量取混合对照品溶液母液0.8 ml，置于25 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合液Ⅱ；精密量取混合对照品溶液母液1 ml，置于10 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合液Ⅲ；精密量取混合对照品溶液母液2 ml，置于10 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合液Ⅳ；精密量取混合对照品溶液母液3 ml，置于10 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合液Ⅴ。按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，以对照品进样量(ng)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性回归方程分别为，Y=6.649X+14.31(R2=0.999)；Y=1.045X+23.21(R2=0.999)；Y=1.318X+32.49(R2=1)。结果显示，(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷分别在16.86～527.00、156.43～4 888.50和122.97 ～3 842.85 ng范围内，线性关系良好[12]。

2.2.3 重复性试验：取样品25 ml，共6份，精密量取，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法测定。结果显示，(R，S)-告依春的RSD为2.8%(n=6)，连翘酯苷A的RSD为1.0%(n=6)，连翘苷的RSD为0.7%(n=6)。以(R，S)-告依春的保留时间和峰面积为参照，共有峰的相对保留时间和峰面积比值基本一致，其RSD均<3.0%，相似度均在0.95以上，符合指纹图谱的技术要求，表明本方法的重复性良好。

2.2.4 耐用性试验：取同一批号的供试品溶液，分别注入两台不同的液相色谱仪。结果显示，两台仪器测得的含量相对偏差均<5%，表明本方法的耐用性良好，见表2、图2。

表2 不同液相色谱仪的考察结果Tab 2 Inspection results of different liquid chromatograph

A.对照品混合溶液；B.供试品溶液A.Mixed solution for reference; B.Solution for testing product图2 高效液相色谱图(液相色谱仪品牌：Waters)Fig 2 High performance liquid chromatography (brand of liquid chromatograph: Waters)

2.2.5 稳定性试验：取样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、6、12、22及32 h测定其峰面积。结果显示，(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷峰面积的RSD分别为0.4%、0.6%和0.5%。以(R，S)-告依春的保留时间和峰面积为参照，共有峰的相对保留时间和峰面积比值基本一致，其RSD均<3.0%，相似度均在0.95以上，符合指纹图谱的技术要求，表明仪精密度良好，表明样品在32 h内稳定[13]。

2.2.6 准确度试验：精密吸取抗病毒口服液样品[已知(R，S)-告依春含量为36.38 μg/ml，连翘酯苷A含量为663 μg/ml，连翘苷含量为170 μg/ml]10 ml，共6份，置于分液漏斗，分别精密加入混合对照品溶液[每1 ml含(R，S)-告依春0.263 5 mg、连翘酯苷A 4.488 6 mg和连翘苷1.241 7 mg]1.5 ml，自“用饱和正丁醇振摇提取4次”起，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法测定并计算加样回收率及RSD。结果显示，(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷的平均加样回收率分别为89.9%、93.5%和95.1%，RSD分别为2.9%、3.6%和0.8%，表明本方法的准确度较好。

2.2.7 专属性试验：分别吸取按“2.2”项下制得的对照品混合溶液、供试品溶液与阴性样品溶液各5 μl，注入液相色谱仪。结果显示，板蓝根、连翘阴性样品均无干扰(见图1)。

2.2.8 样品含量测定：用本方法测定40批次抗病毒口服液中(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷的含量结果显示，(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷含量的总平均值分别为25.91、249.35和98.78 μg/ml。

2.3 指纹图谱的建立及相似度分析

2.3.1 指纹图谱的建立及共有指纹峰的标定：比较各批次供试品的色谱图，其中9个色谱峰是共有的，确定为共有指纹峰，见图2；经确认，对照图谱中峰4与峰5之间的大峰为防腐剂山梨酸钾与苯甲酸钠的生成峰,见图3。

2.3.2 指纹图谱色谱峰的鉴定：经过与对照品比较，鉴定其中色谱峰，峰2为(R，S)-告依春，峰4为芒果苷，峰5为连翘酯苷Ⅰ，峰6为连翘酯苷H，峰7为连翘酯苷A，峰8为松脂酚-4-O-葡萄糖苷，峰9为连翘苷[14]。

2.3.3 抗病毒口服液高效液相指纹图谱的建立：取40批次抗病毒口服液样品，分别按供试品溶液的制备与检验方法进行检测，记录指纹图谱。以(R，S)-告依春(峰2)为参照峰，计算得出各共有峰的相对保留时间的RSD均<0.3%，符合指纹图谱的要求。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对40批次样品的指纹图谱进行分析，以第1批抗病毒口服液的指纹图谱作为参照图谱，生成40批次样品的对照指纹图谱(见图3)。结果显示，40批次抗病毒口服液与对照指纹图谱相似度的平均值为0.911，具有良好的相似性。经确认，对照图谱中峰4与峰5之间的大峰为防腐剂山梨酸钾与苯甲酸钠的生成峰，见图4。40批次样品高效液相指纹图谱叠加见图5。

2.3.4 指纹图谱耐用性考察：取同一批号的供试品溶液，分别注入两台不同的液相色谱仪，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，以生成的对照指纹图谱作为参照图谱，对两台仪器测得的样品指纹图谱进行分析。结果显示，Agilent品牌液相色谱仪得出的相似度为0.869，Waters品牌液相色谱仪得出的相似度为0.868，相对偏差为0.1%，两者相似度相近[15]。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

在常规的中药高效液相色谱质量分析中，由于成分测定往往以其最大波长作为检测波长[16]，而指纹图谱往往以出峰最多、丰度较高的波长作为检测波长，故以往的研究往往将二者独立起来。随着可变波长的应用，可将每类成分的最大波长作为测定波长，既能满足指纹图谱的峰数和丰度，也能满足含量测定的灵敏度；采用可变波长后，指纹图谱和多指标成分可在同一色谱条件下检测。通过比较(R，S)-告依春、连翘酯苷A和连翘苷的紫外光谱扫描及指纹图谱三维图，波长为236 nm时，定量成分及特征峰的信息量、分离度及各色谱峰相对比例综合效果较好，干扰少。