外用苯烯莫德对特应性皮炎样小鼠的治疗作用

兰宇贞 慕彰磊 赵 琰 孙 婧 张建中

苯烯莫德是一种小分子化合物，化学名为5-(2-苯乙烯基)-2-异丙基-1，3-苯二酚，是一种新型非激素类免疫调节剂[1]。国外一项临床研究显示，外用苯烯莫德乳膏对特应性皮炎具有治疗作用[2]，但其作用机制目前仍不清楚, 也无与糖皮质激素及钙调神经磷酸酶抑制剂的对比研究。卡泊三醇(MC903)外用于BALB/c小鼠可诱导出红斑、干燥、鳞屑、水肿、渗出、皮肤肥厚等特应性皮炎(AD)样皮肤症状，可见表皮增生，嗜酸细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等炎症细胞浸润，促进角质形成细胞合成胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)，较好的复制了AD的重要特征[3,4]。MC903诱导的AD样小鼠模型，已经得到国际公认。本研究利用MC903诱导的AD样BALB/c小鼠模型，观察外用苯烯莫德乳膏对AD的治疗作用，并与糖皮质激素及钙调神经磷酸酶抑制剂相比较，本研究还观察了苯烯莫德治疗对AD样小鼠皮肤屏障功能及部分免疫反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 6周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华公司(北京)。MC903购于Sigma公司。0.5%、1.0%苯烯莫德乳膏及乳膏基质均由天济药业(深圳)有限公司提供。兔抗人TSLP抗体、兔抗人CD4抗体均购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及药物处理 36只小鼠随机分为6组，每组6只，即：正常对照组、基质组、0.5%苯烯莫德组、1.0%苯烯莫德组、0.1%糠酸莫米松组和0.1%他克莫司组。正常对照组不予任何处理；分别将1 nmol(10 μL)MC903溶液均匀涂于其余小鼠的每侧耳背皮肤，连续9天，于第10天对所有小鼠的耳部皮损进行评分，并根据分组情况给药治疗12天。正常对照组不予任何药物；其余小鼠每日上午8时涂抹1 nmol(10 μL)MC903溶液维持模AD模型，上午10时按分组涂抹50 μL相应药物于双侧耳背。

1.2.2 皮损评分 分别于治疗前和治疗12天后，对小鼠耳部皮损评分。评分根据症状分为红斑/充血、鳞屑/干燥、水肿三项，每项根据症状的轻重程度评为0～3分：0(无症状)、1(轻度)、2(中度)、3(重度)。以三项评分相加所得总分评估皮损的严重程度。

1.2.3 耳部皮肤厚度测量和经皮水丢失(TEWL)检测 分别于治疗前后，用游标卡尺测量小鼠耳部厚度，并进行记录。治疗12天后，使用经皮水丢失记录仪TewameterTM300对各组小鼠的耳背皮肤进行经皮水丢失(TEWL)测定。

1.2.4 HE染色及免疫组化 剪下小鼠耳部组织，将其中一侧置于4%多聚甲醛固定24 h，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，制备切片(4 μm)。HE染色，观察各组小鼠皮损组织病理变化；分别使用兔抗人TSLP抗体、兔抗人CD4抗体进行免疫组化染色，并于每张切片取3个高倍视野(×400)计数表达TSLP表皮细胞、CD4+T细胞数量。

1.2.5 统计学方法 所有数据均以均数±标准差表示，应用SPSS 24.0统计软件分析，每组前后比较采用配对样本t检验，各组比较采用One-way ANOVA分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苯烯莫德治疗对AD样BALB/c小鼠耳部皮损评分的影响 AD样小鼠双侧耳背表现出明显红斑、充血、干燥、水肿、鳞屑，耳部皮肤明显增厚。治疗12天后，0.5%苯烯莫德、1.0%苯烯莫德、0.1%糠酸莫米松及0.1%他克莫司组小鼠耳部红斑、鳞屑、水肿及毛细血管扩张程度均明显减轻(图1)。治疗前后，AD样小鼠皮损评分见表1。治疗前基质组、0.5%苯烯莫德组、1.0%苯烯莫德组、糠酸莫米松组、他克莫司组均高于正常对照组，AD样小鼠各组之间无明显差异。治疗12天后，0.5%苯烯莫德乳膏组较治疗前降低60.36%(t=25.298,P<0.001)；1.0%苯烯莫德乳膏组降低63.76%(t=9.286,P<0.001)，两组评分均明显低于同期基质组(F=62.127,P<0.001)，与糠酸莫米松组差异无显著性，1.0%苯烯莫德组显著低于他克莫司组(P<0.05)，0.5%苯烯莫德组与他克莫司组及1.0%苯烯莫德组比较，差异无显著性。见表1。

a:正常对照组; b:基质组；c:0.5%苯烯莫德组；d:1.0%苯烯莫德组；e:0.1%糠酸莫米松组；f:0.1%他克莫司组

表1 治疗前后各组小鼠皮损评分

注：n=6，与正常对照组比较a：P<0.01；与基质组比较b：P<0.01

2.2 苯烯莫德治疗前后耳部皮肤厚度变化 治疗前AD样小鼠耳部皮肤厚度高于正常对照组(F=89.113,P<0.01)。治疗12天后， 1.0%苯烯莫德组、0.5%苯烯莫德组小鼠耳部皮肤厚度均较治疗前减小(t值分别为14.050和15.704，均P<0.001)。治疗组均小于基质组，(F=111.725，均P<0.001)。其中，0.1%糠酸莫米松组明显小于其他三组，P<0.05；1.0%苯烯莫德组、0.5%苯烯莫德组与他克莫司组无显著性差异；1.0%苯烯莫德组小于0.5%苯烯莫德组，P<0.05。见表2。

2.3 苯烯莫德治疗后AD样BALB/c小鼠皮肤组织结构的变化 AD样小鼠组织病理可见表皮显著增生，棘层肥厚，角化过度及不全，表皮内可见细胞间水肿，真皮浅中层毛细血管扩张，血管周围可见较致密的单一核细胞浸润，并可见嗜酸性粒细胞浸润。与基质组相比，治疗组小鼠的表皮增生、单一核细胞浸润及嗜酸粒细胞浸润程度明显减轻(图2)。

2.4 苯烯莫德治疗对AD样BALB/c小鼠TEWL的影响 基质组小鼠TEWL显著高于正常对照组(F=19.319，P<0.001)；0.5%苯烯莫德组、1.0%苯烯莫德组、0.1%糠酸莫米松组、0.1%他克莫司组均显著低于基质组(P<0.01)；0.5%苯烯莫德组和1.0%苯烯莫德组均低于糠酸莫米松组(P<0.05)，与他克莫司组比较无显著差异；0.5%苯烯莫德组与1.0%苯烯莫德组比较差异不显著(图3)。

表2 治疗前后各组小鼠耳部皮肤厚度

注：n=6，与正常对照组比较a：P<0.01；与基质组比较b：P<0.01

a：正常对照组; b：基质组；c：0.5%苯烯莫德组；d：1.0%苯烯莫德组；e：0.1%糠酸莫米松组；f：0.1%他克莫司组

图3 治疗后各组小鼠经皮水丢失程度(与基质组比较：**P<0.01)

2.5 苯烯莫德治疗对AD样BALB/c小鼠皮损内CD4+T细胞的影响 治疗后，基质组皮损内CD4+T细胞浸润程度显著高于正常对照组。糠酸莫米松组、1.0%苯烯莫德组、0.5%苯烯莫德组和他克莫司组均较基质组减轻(F=44.794，P<0.01)。0.5%和1.0%苯烯莫德组与0.1%糠酸莫米松组及0.1%他克莫司组比较均无显著性差异，0.5%和1.0%苯烯莫德组之间比较差异亦不显著(图4、5)。

2.6 苯烯莫德治疗对AD样BALB/c小鼠皮损内TSLP表达的影响 免疫组化结果显示，与正常对照组相比，基质组小鼠TSLP蛋白表达水平明显升高，1.0%苯烯莫德组、糠酸莫米松组、他克莫司组和0.5%苯烯莫德组，均较基质组下调(F=70.833，P<0.01)。其中，1.0%苯烯莫德组和0.1%糠酸莫米松组显著低于0.5%苯烯莫德组(P<0.05)，其余各治疗组之间无显著性差异(图6、7)。

a：正常对照组;b：基质组；c：0.5%苯烯莫德组；d：1.0%苯烯莫德组；e：0.1%糠酸莫米松组；f：0.1%他克莫司组

图5 CD4+T细胞计数(与基质组比较：**P<0.01)

3 讨论

特应性皮炎(atopic dermatits，AD)是一种慢性炎症性皮肤病，以剧烈瘙痒和复发性湿疹样皮损为特征[5]。近年来，AD的发病率在世界范围内逐年上升，部分国家儿童患病率超过20%，成人患病率为10%～20%[6]。AD的一线治疗包括润肤剂和外用药物，目前AD的外用药物以糖皮质激素和钙调神经磷酸酶抑制剂为主，二者长期用药均存在安全性隐患。

苯烯莫德是国家1.1类新药，是一种新型非激素类免疫调节剂[7]。临床研究显示，外用苯烯莫德可以显著而快速的减轻斑块状银屑病的皮损，疗效优于糖皮质激素及卡泊三醇[8]。苯烯莫德能促进来源于白癜风患者正常皮肤的黑素细胞系PIG3V细胞的增殖、迁移，使酪氨酸酶活性及黑素含量增加，可能直接促进白癜风患者黑素细胞发挥合成黑素的功能[9]。国外一项临床研究显示，与安慰剂组相比，外用苯烯莫德乳膏对轻到重度特应性皮炎患者的湿疹面积及严重程度评分(EASI)、临床SCORAD评分(包括瘙痒严重程度)均有明显改善，且安全性较好[2]

a：正常对照组; b：基质组；c：0.5%苯烯莫德组；d：1.0%苯烯莫德组；e：0.1%糠酸莫米松组；f：0.1%他克莫司组

图7 表达TSLP的表皮细胞计数(与基质组比较：**P<0.01)

本研究结果显示，苯烯莫德可明显减轻AD样小鼠的红斑、鳞屑及水肿症状，及耳部皮肤厚度。治疗12天后AD样小鼠耳部皮损评分较治疗前显著降低。治疗后，小鼠耳部皮肤厚度明显减小，其中1.0%苯烯莫德较0.5%苯烯莫德效果更好。提示苯烯莫德对AD具有较好的治疗作用，且治疗效果与苯烯莫德浓度相关。

AD的发病机制非常复杂，环境因素、遗传因素、皮肤屏障功能受损及免疫系统异常均参与发病，并可相互作用。其中皮肤屏障功能及免疫异常是两大主要因素，也是目前受关注最多的因素。

AD患者常出现特征性的皮肤干燥，以及TEWL增加，这意味着他们皮肤屏障功能受损[10]。本研究发现1.0%与0.5%苯烯莫德乳膏均可降低AD样小鼠的TEWL程度，效果优于0.1%糠酸莫米松，提示苯烯莫德乳膏有修复皮肤屏障的修复作用。AD样小鼠耳部CD4+T细胞浸润明显，表皮细胞TSLP表达增加，这与AD的病理生理特征一致。本研究发现，苯烯莫德乳膏治疗后，AD样小鼠局部CD4+T细胞浸润显著减轻，TSLP表达下调，与0.1%糠酸莫米松及他克莫司组无显著差异。TSLP可激活树突状细胞，刺激原始CD4+T细胞产生Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-13及TNF-α，活化神经元细胞和免疫细胞导致瘙痒产生，诱导树突状细胞和角质形成细胞表达胸腺和活化调剂趋化素(TARC/CCL17)和巨噬细胞趋化因子(MDC/CCL12)，而CCL17可以通过与Th2细胞表达的CC趋化受体4(CCR4)相结合从而趋化Th2细胞[11，12]。有研究显示AD严重程度与血清TSLP及CCL17水平相关[13]。本研究结果提示苯烯莫德可减轻MC903诱导的AD样小鼠的局部炎细胞浸润，可能通过下调TSLP，抑制Th2细胞因子表达来实现。